Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise

Resumo

Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.

Resumo

Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer "criofixação" de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas "características" energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.

Introdução

Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas ^3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo ....

Protocolo

A abordagem descrita aqui foi desenvolvido utilizando instrumentos específicos, ferramentas e software. Porque laboratórios não vai usar a mesma configuração experimental da abordagem é generalizada sempre que possível.

1. Congelação rápida

O método analítico para ser descrito é absolutamente dependente abordagens criogénicos para: 1) o "criofixação" de células ou tecidos de uma maneira que preserva quantitativamente a distribuição dos componentes do tecido difusíveis e elementos químicos que foram em células vivas, no momento da congelação e 2) a preparação de ultrafinos criosecções adequado para imagem e análi....

Resultados

As células do cérebro tipicamente sustentar lesão excitotoxic como resultado da liberação de neurotransmissores patológico que ocorre em condições de isquemia. EPMA foi fundamental para descobrir como a capacidade das mitocôndrias neuronais de sequestrar grandes quantidades de cálcio subjacente ao mecanismo de lesão. A fotografia de microscopia electrónica na Figura 3 ilustra o aparecimento de mitocôndrias nos criocortes liofilizados de neurónios do hipocampo em cultura rapidamente congelados após 30 mi.......

Discussão

O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma coloração é necessár.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox lamínulas de plástico	Thermo Fischer Scientific	72280
Inserções de cultura	BD Falcon	353090	Para placas de 6 poços
Criopinas	Leica Microsystems	16701952
aplicadores de madeira	EM Sciences	72300
Grades EM dobráveis	Ted Pella	4GC100 / 100	100 mesh
Folha de índio	Alfa Aesar	13982	0,25 mm de espessura
EQUIPMENT
Dispositivo de congelamento por imersão	Leica Microsystems	KF-80
Dispositivo de congelamento	LifeCell	CF-100
Ultramicrótomo	Leica Microsystems	UC6
Cryoattachment para micrótomo	Leica Microsystems	FC6
Ferramenta de criocorte de diamante	Diatome	Cryotrim 45
Faca criocortadora de diamante	Diatome	Cryo 35
Dispositivo antiestático	Diatome	Hauf Linha
Microscópio eletrônico criogênico	Carl Zeiss Microscopia	EM912 Omega
Suporte de amostra criogênica EM	Gatan	CT3500
Câmera CCD de varredura lenta, 2k x 2k	Troendle (TRS)
	SIS	iTEM suite
ED Detector de raios-x ED	Instruments	Linksystem Processador
	Oxford Instruments	XP-3
PCI backplane cartão	4pi Systems	Spectral Engine II
Computador de mesa	Apple	Qualquer modelo
Software de análise de raios-X	NIST	DTSA, DTSA II
Software de planilha	Microsoft	Excel
O CF100 não é mais vendido comercialmente, embora a máquina esteja disponível em muitas instalações acadêmicas, e máquinas ou peças completas podem ser encontradas on-line. Um tutorial em vídeo para o suporte de criotransferência CT3500 está disponível em http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. O SEII está obsoleto; o Universal Spectral Engine É um produto posterior compatível com PC com funcionalidade comparável. A 4pi cessou a fabricação e as vendas, mas ainda fornece suporte técnico ao cliente. Os sistemas usados são frequentemente encontrados online. O DTSA original agora está obsoleto. O NIST oferece em domínio público um sucessor atualizado, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

ranhurada Estática Software de aquisição de imagem Olympus Oxford de pulso Pentafet compatível com OS9