Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo
Summary
Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.
Abstract
Precipitação com fosfato de cálcio é um método conveniente e económico para a transfecção de células em cultura. Com a otimização, é possível usar esse método em células de difícil transfecção como neurônios primários. Aqui nós descrevemos o nosso protocolo detalhado para a transfecção de fosfato de cálcio dos neurônios do hipocampo co-cultivadas com células gliais.
Introduction
Neurónios primários são um dos tipos de células difíceis de transfectar, como eles são pós-mitótico e são muito sensíveis às alterações de micro-ambientais. Existem quatro tipos vulgarmente utilizados para os métodos de expressão de genes exógenos e RNAs de curto hairpin (shRNAs) nestas células 1. Cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Por exemplo, a electroporação, são geralmente realizados em neurónios recentemente isolados 2, como as células têm de ser transferidos para cuvetes de transfecção. Infecção pelo vírus geralmente pode alcançar uma eficiência muito alta 3, mas é mais trabalhoso e arriscado para os operadores. Muitos reagentes de transfecção mediada por lipidos são disponíveis comercialmente, com variados graus de sucesso em neurónios e diferentes níveis de citotoxicidade.
Transfecção com fosfato de cálcio representa um método conveniente e económico para a introdução de genes estranhos em neurónios. O método foi usado pela primeira vez para introduzir o DNA do adenovírus em cel mamíferosls por Graham e Van der Eb (1973) 4. A transfecção foi realizada por mistura de cloreto de cálcio com o ADN recombinante, em tampão fosfato. Isto permite a formação de fosfato de DNA / precipitados de cálcio que, quando gradualmente libertado para uma monocamada de células, aderem à superfície da célula, são ocupados por endocitose e, finalmente, entrar no núcleo 5. Este processo conduzirá à expressão de genes estranhos introduzidos na célula alvo. Eficiência típicos de cálcio gama de transfecção de fosfato de entre 0,5-5% 6-8. No entanto, com cuidado e optimização execução consistente do protocolo experimental, é possível atingir uma eficiência de transfecção de quase 50%. Aqui, descrevemos a protocolo detalhado para a transfecção com fosfato de cálcio de neurónios do hipocampo primárias, que são co-cultivadas com células gliais em um formato de sanduíche 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários parâmetros-chave que precisam ser cuidadosamente controlado para transfections consistentemente bem sucedidos 10,11. O parâmetro mais crítico para a transfecção de fosfato de cálcio é o valor de 2x HBS, que nas nossas mãos geralmente varia entre 7,10-7,15 pH. Recomendamos fazer três lotes de ações com valores de pH em 0,05 incrementos para explicar a diferença entre os medidores de pH. Alternativamente, o kit de transfecção de mamíferos Clontech fornece 2x HBS que sempre rende u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo NIH conceder NS065183 e fundos de arranque da Faculdade de Medicina Robert Wood Johnson Rutgers.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
Referências
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