Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Summary

Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.

Abstract

Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.

Introduction

Neuronas primarias son uno de los tipos de células más difíciles de transfectar ya que son postmitotic y son muy sensibles a los cambios micro-ambiental. Hay cuatro tipos de uso común de los métodos para la expresión de genes exógenos y los ARN corto horquilla (shRNAs) en estas células ^1. Cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, electroporación se realiza generalmente en las neuronas recién aisladas ^2, como las células deben ser transferidos en las cubetas para la transfección. Infección por el virus generalmente se puede lograr una eficiencia muy alta ^3, pero es y arriesgado para los operadores más intensivos en mano de obra. Muchos reactivos de transfección mediadas por lípidos están disponibles comercialmente, con diversos grados de éxito en las neuronas y diferentes niveles de citotoxicidad.

Transfección con fosfato de calcio representa un método conveniente y económico para la introducción de genes extraños en las neuronas. El método fue utilizado por primera vez para introducir ADN adenovirus en cel mamíferosls por Graham y Van Der Eb (1973) ^4. La transfección se realizó mediante la mezcla de cloruro de calcio con el ADN recombinante en un tampón de fosfato. Esto permite la formación de fosfato de ADN / calcio precipitados que, cuando se deja caer poco a poco sobre una monocapa de células, se adhieren a la superficie celular, son absorbidos por endocitosis y finalmente entrar en el núcleo ^5. Este proceso daría lugar a la expresión de genes extraños introducidos en la célula diana. Eficiencias típicas de calcio gama transfección con fosfato de entre 0,5-5% ^6-8. Sin embargo, con la optimización cuidadosa y ejecución consistente del protocolo experimental, es posible llegar a una eficacia de transfección de casi el 50%. Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo primarias, que se co-cultivaron con células astroglial en un formato sándwich ^9.

Protocol

1. Preparación Rata Astrocyte la cultura para el medio condicionado y astrocitos-neuronas cocultivos. Prepare el tampón de disección (BSS, véase la Tabla 1 para la receta) y se almacena a 4 ° C hasta que esté listo para su uso. Anestesie crías de ratas neonatales (P0-P2) con isoflurano en un vaso de 500 ml. Cuando los cachorros son inmóviles, rocíe con etanol al 70% y decapitar. Retire el cerebro. Sostenga firmemente la cabeza con un par de Dumo…

Representative Results

Cuando los diferentes parámetros de la transfección se optimizan y controlan cuidadosamente de experimento a experimento, es posible obtener eficiencias de transfección de hasta el 50%. La Figura 1 muestra un campo de neuronas que están transfectadas con GFP en DIV4. El campo contiene un total de 28 neuronas, entre los cuales 16 fueron transfectadas. Esto representa un rendimiento de más del 50%. Un muestreo de otros campos de la misma cubreobjetos muestra la eficiencia global es de alrededor de 50…

Discussion

Hay varios parámetros clave que deben ser cuidadosamente controlada para transfecciones consistentemente exitosos ^10,11. El parámetro más crítico para la transfección de fosfato de calcio es el valor de pH de 2x HBS, que en nuestras manos por lo general varía entre 7.10 hasta 7.15. Se recomienda hacer tres lotes de acciones con valores de pH en incrementos de 0.05 para dar cuenta de la diferencia entre los medidores de pH. Alternativamente, el kit de transfección de mamíferos Clontech proporciona 2x H…

Materials

Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-20
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09	straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors	Fine Science Tools	15008-08	angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-16
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91401-14	blunt / 14.5 cm
Spring scissors	Fine Science Tools	15006-09	angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane	Webster Veterinary	14043-225-06
Poly-L-lysine	Sigma	P2636
MEM	Sigma	M2279
100 mM Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Glucose	Sigma	G8270
10x HBSS	Sigma	H4385
1 M HEPES, pH 7.3	Gibco/Invitrogen	15630-080
GlutaMAX	Gibco/Invitrogen	35050-061
Neurobasal Media	Gibco/Invitrogen	21130-049
B27 Supplement (50x)	Gibco/Invitrogen	17504-044
N2 Supplement	Gibco/Invitrogen	17502-048
Ovalbumin	Sigma	A5503
Penicillin/Streptomycin	Gibco/Invitrogen	15070-063
2.5% Trypsin	Gibco/Invitrogen	15090-046
DNase I	Sigma	DN-25
Cytosine arabinoside	Calbiochem/EMD Millipore	251010
Kynurenic acid	Sigma	K3375