मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग
Summary
इस विधि दरार घाटी बुखार वायरस (RVFV) तनाव सांसद-12 के साथ संक्रमण के बाद मेजबान सेल प्रतिलेखन में परिवर्तन को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान के उपयोग का वर्णन करता है. परिणाम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से गुणात्मक कल्पना या प्रवाह के माध्यम से मात्रात्मक प्राप्त किया जा सकता है. इस विधि के अन्य वायरस के साथ प्रयोग के लिए अनुकूल है.
Abstract
कई आरएनए वायरस सेलुलर गढ़ नाकाम करने के लिए एक साधन के रूप में मेजबान सेल प्रतिलेखन बाधित करने की क्षमता विकसित किया है. इन वायरस के अध्ययन के लिए, संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि को मापने का एक त्वरित और विश्वसनीय तरीका है इसलिए यह महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, प्रतिलेखन एच uridine ऐसे immunostaining के माध्यम से पता लगाने के द्वारा पीछा 5 bromouridine (ब्रू) के रूप में halogenated uridine analogs के autoradiography या जगमगाहट गिनती, या समावेश के माध्यम से पता लगाने के द्वारा पीछा 3 जैसे रेडियोधर्मी nucleosides का समावेश करके भी मापा गया है. ब्रू का पता लगाने के बोझिल हो सकता है और कम संवेदनशीलता से पीड़ित हो सकता है, जबकि रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग करते हैं, तथापि, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और प्रयोगशाला सेटिंग्स की संख्या में संभव नहीं है.
एक azide और एक alkyne से एक तांबे उत्प्रेरित triazole गठन शामिल है जो हाल ही में विकसित क्लिक करें रसायन विज्ञान,, अब एक तेजी से और highl प्रदान करता हैइन दो तरीकों के लिए वाई संवेदनशील वैकल्पिक. क्लिक रसायन शास्त्र नवजात आरएनए पहले एक फ्लोरोसेंट azide के साथ लेबल का पता लगाने के द्वारा पीछा uridine अनुरूप 5 ethynyluridine (ईयू) के समावेश द्वारा लेबल है जिसमें एक दो कदम प्रक्रिया है. ये azides दृश्य के लिए विकल्प की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है, कई अलग fluorophores के रूप में उपलब्ध हैं.
इस प्रोटोकॉल तनाव सांसद -12 क्लिक करें रसायन विज्ञान का उपयोग कर दरार घाटी बुखार वायरस (RVFV) से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional दमन को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. समवर्ती, इन कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शास्त्रीय इंट्रासेल्युलर immunostaining के द्वारा निर्धारित किया जाता है. 8 विस्तार प्रवाह के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल दमन यों के लिए एक विधि के माध्यम से 5 कदम है, जबकि 4 विस्तार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल दमन कल्पना करने के लिए एक विधि के माध्यम से कदम 1. इस प्रोटोकॉल अन्य वायरस के साथ प्रयोग के लिए आसानी से अनुकूल है.
Introduction
परंपरागत रूप से, transcriptional गतिविधि रेडियोधर्मी (3 एच uridine) 1 या तो के समावेश के माध्यम से मापा या नवजात शाही सेना में (BRU) 2 nucleosides halogenated किया गया है. ये uridine एनालॉग, कोशिकाओं द्वारा उठाया न्यूक्लीओसाइड उबार मार्ग के माध्यम से uridine-triphosphate (UTP) में परिवर्तित किया, और बाद में नए संश्लेषित शाही सेना में शामिल किया. 3 एच uridine समय लेने वाली हो सकती है, जो autoradiography, या जगमगाहट से पता लगाया जा सकता है कर रहे हैं विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, जो गिनती. इसके अलावा, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग उच्च रोकथाम जैव सुरक्षा प्रयोगशालाओं सहित, प्रयोगशाला सेटिंग्स की संख्या में व्यावहारिक नहीं हो सकता. ब्रू शाही सेना माध्यमिक संरचना एंटीबॉडी के बंधन के लिए एक steric बाधा हो सकता है के रूप में नाभिक या शाही सेना के आंशिक विकृतीकरण, के लिए एंटीबॉडी का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कठोर permeabilization की आवश्यकता हो सकती है, जो विरोधी ब्रू एंटीबॉडी के साथ immunostaining के माध्यम से पता लगाया जा सकता है.
_content "> यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हाल ही में RVFV तनाव सांसद -12 से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि को मापने के लिए रसायन शास्त्र 3 क्लिक विकसित की है. क्लिक करें रसायन विज्ञान के एक उच्च चयनात्मक और कुशल तांबे (आई) उत्प्रेरित एक alkyne और बीच cycloaddition प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है इस्तेमाल 4,5 एक azide के आधा भाग. इस प्रोटोकॉल में, संक्रमित कोशिकाओं में नवजात आरएनए पहले uridine अनुरूप यूरोपीय संघ के समावेश के माध्यम से लेबल है. चरण में एक दूसरे, शामिल यूरोपीय संघ के एक फ्लोरोसेंट azide के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से पता चला है. इस विधि का मुख्य लाभ हैं (1) यह रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और (2) है कि यह कठोर permeabilization या शाही सेना के विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं होती. अपर्याप्त द्वारा बाधा नहीं है कम से कम 50 दा, फ्लोरोसेंट azide के उपयोग की एक आणविक वजन के साथ एक वर्ग के साथ शाही सेना का पता लगाने के संयोजन जब permeabilization या शाही सेना माध्यमिक संरचना. इसके अलावा, शोधकर्ताओं प्राथमिक एंटीबॉडी की अपनी पसंद में सीमित नहीं हैंवायरल प्रोटीन के लिए राजनैतिक immunostaining के.दो अलग अलग तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चरण 1-4), और प्रवाह cytometry (चरण 5-8) के माध्यम से प्रतिलेखन बढ़ाता के लिए एक माध्यम प्रतिलेखन दृश्यमान करने के लिए एक. इन दोनों पद्धतियों के एक सेल से सेल आधार पर transcriptional गतिविधि और वायरल संक्रमण के बीच एक संबंध के लिए अनुमति देता है वायरल प्रोटीन, के लिए एक intracellular immunostaining के साथ नवजात शाही सेना की लेबलिंग गठबंधन.
लेखकों सफलतापूर्वक प्रोटोकॉल RVFV तनाव सांसद -12 6, Toscana के वायरस (TOSV) 10 से संक्रमित विभिन्न सांसद -12 म्यूटेंट 7,8, 9, और कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि का निर्धारण करने के लिए यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न वायरस के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित और विशिष्ट वायरल या सेलुलर प्रोटीन की immunofluorescence धुंधला शामिल करने के लिए संशोधित करने की क्षमता है किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रदान की प्रोटोकॉल नवजात शाही सेना में uridine अनुरूप यूरोपीय संघ के समावेश के माध्यम से मेजबान सेल प्रतिलेखन पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. यह तेजी से संवेदनशील है, और…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माउस पॉलीक्लोनल विरोधी RVFV सीरमरोधी और प्रवाह के साथ मदद के लिए UTMB फ्लो कोर सुविधा के एम. ग्रिफिन प्रदान करने के लिए आरबी Tesh धन्यवाद. इस काम UTMB.OL पर जेम्स डब्ल्यू McLaughlin फैलोशिप कोष समर्थित किया गया था द्वारा समर्थित UTMB.BK में टीके के विकास के लिए Sealy केंद्र से पश्चिमी क्षेत्रीय उत्कृष्टता के केंद्र, एनआईएच अनुदान R01 AI08764301, और धन के माध्यम से 5 U54 AI057156 द्वारा समर्थित किया गया एक मौरिस आर Hilleman अर्ली स्टेज कैरियर अन्वेषक पुरस्कार से.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Referências
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
