酵母発光測定と<em>アフリカツメガエル</emTRPV4の分子機械的感受性の>卵母細胞電気生理学的検定試験
Summary
TRPV4のを研究するためによく使用されるメソッドを補完するために、二つの方法が記載されている：その機械的感受性は、低浸透チャレンジの際に遺伝子組換え酵母中のCa 2 +-エクオリン発光測定により研究することができる。また、オンセルまたは切除されたモードでクランプ全細胞の2電極電圧クランプまたはパッチによりアフリカツメガエル卵母細胞に注入TRPV4-RNAで検査することができる。
Abstract
TRPV4（一過性受容体電位バニロイドファミリー、タイプ4）が広く脊椎動物の組織において発現され、機械的な力によるものを含むいくつかの刺激によって活性化される。特定のTRPV4の変異は、人間の複雑な遺伝性骨や神経細胞の病状を引き起こす。野生型または変異TRPV4導入遺伝子は、一般的に培養された哺乳動物細胞で発現し、フラ-2蛍光法により、電極によって検査されています。機械的感受性のメカニズムと疾患の分子基盤の面では、現在の文献は混乱し、物議を醸している。既存のメソッドを補完するために、我々はTRPV4の分子特性を調べるために二つのメソッドを記述します。 （1）ラットTRPV4およびエクオリン導入遺伝子は、出芽酵母に形質転換する。形質転換体の人口の低刺激osmticショックはTRPV4チャネルを通じて放出によるCa 2 +を持つイクオリンの組み合わせに発光測定信号が得られます。ここでは、TRPV4は通常の哺乳類のパートナータンパク質から分離されているそして、独自の機械的感受性を明らかにする。 （2）TRPV4のcRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入される。適当なインキュベーション期間の後、TRPV4巨視的な電流は、2電極電圧クランプを用いて試験される。卵母浴からの不活性浸透圧調節物質の除去の際に電流の上昇は機械的感受性の指標である。卵母細胞からのマイクロアンペア（10 -6 A -4〜10）の電流が明確に定量化し、より多くの自信を持って評価を得培養細胞からナノアンペアサブナノへ（10 -10 A -9〜10）の電流よりもはるかに大きい。個々のチャネルタンパク質の活性を反映微視的電流も上に直接細胞または切除されたモードでは、パッチクランプの下に登録することができる。同じ卵母細胞は、より良いデータ複製が可能、複数のパッチのサンプルが用意されています。パッチに適用される吸引は直接機械的感受性を評価するためにTRPV4を活性化することができる。これらの方法は、TRPチャネルの他のタイプの研究に有用であるはずである。
Introduction
のTRP（一過性受容体電位）が感覚機能を、1,2を果たす陽イオンチャネルの7のサブファミリーを構成する。哺乳類では、TRPV、のTRPのバニロイドサブファミリーは、6種類があります。 TRPV4（タイプ4） の3,4熱に反応する、特定の化学物質、浸透圧膨張、またはせん断応力。 TRPV4遺伝子を繰り返し、候補遺伝子および/ または5-8発現クローニングによって単離した。後者の方法は、低刺激浸透圧モル濃度の遺伝子産物の応答を行った。 TRPV4は、開発、生理学、または多くの異なる細胞型の病理3,4のほぼ全ての器官および機能に発現される。
印象的には、末梢神経障害および/ または骨格異形成（骨格の発達の異常）9月11日に発生し、> 50人の常染色体優性のTRPV4変異である。セベ軽度brachyomiaタイプ3（タイプ3小人症）、spondylometaphyseal異形成コズロウスキータイプから骨格異形成範囲異形成RE、いくつかは、新生児または胚死を引き起こす。メカニズムのすべてのマナーが可能に見えるけど、どれも多様性、複雑性、多様性、およびこれらの疾患4の時々の重なりを説明していません。
他のTRPチャネル1と同様に、TRPV4は四量体である。ラットまたはヒトTRPV4では、各サブユニットは871残基から構成されている。その中心的な要素は、おそらく電位依存性K +チャネルと同様に配置された6つの膜貫通ヘリックス（S1-S6）である。そこでは、S1〜S4は、周辺領域を形成し、S5およびS6は、透過孔のドメインを形成する。 TRPV4のS5、S6の間、おそらく陽フィルタを形成するために収束そのうちの4つのシーケンスLDLFKLTIGMGDL、続く短いポアへリックスである。 470残基のN末端細胞質セグメントは、タンパク質または小リガンドを結合することが知られている6アンキリンリピートを含んでいます。 C末端152残基の細胞質セグメントは、OT結合する他の候補地の中でカルモジュリン結合配列を含む彼女の要素3。
TRPV4は、基本的に陰イオン1を除いた陽イオンチャネルである。その生理的機能は、Ca 2 +流入に刺激を伝達することですが、それは、P カルシウムの二価に有利、またアイゼンマンIV透過性配列と他の陽イオンを透過させる。P ナ 〜7 12。単一チャネルコンダクタンスは、〜90 psの外側へと〜40 psの内側6,13,14で整流する。異種発現（下）現在は低浸透腫れ、せん断応力、または暖かさ15によって活性化することができる。また、多価不飽和脂肪酸は16,17及び合成ホルボールエステルが18を 4αPDDによって活性化される。現時点では、どちらも高スループット、低分子スクリーニングによって発見された、10 -9〜10 -8 Mの20に効果的で、最も強力なアゴニストはGSK1016790A 19で、アンタゴニストはGSK2193874です。
TRPV4研究の二つの主要な分野は混乱のまま：TRPV4は、主にその機械的感受性のために研究されていても（1）、その分子基盤は、物議を醸している。 1つのモデルは、低刺激オスモル濃度が何らかの方法でエポキシゲナーゼによって酸（EET）をエポキシエイコサトリエンに変換される多価不飽和脂肪酸（PUFA）、アラキドン酸（AA）を生成するために、ホスホリパーゼA2（PLA2）を活性化し、EET の結合は、TRPV4 16を活性化について説明17。しかし、TRPV4自体が直接簡単な説明を提供する、膜ストレッチ14（下）に応答することが示されている。 （2）TRPV4変異体の病状は途方に暮れるです。財団では、人は病気が消失、縮小、またはチャネル活動の増加によるものであるかどうかを知る必要があります。でも、ここで、文献は遠い透明からです。複数の骨格異形成の対立遺伝子は高い活性を有することが報告されたが、（機能獲得、GOF）4,21は 、いくつかは、活動（機能喪失、LOF）10,22が低下していると報告された。 14対立遺伝子の体系的な研究は、それらを発見すべてのGOFする変異（下）23。 TRPV4機能の完全な損失にもかかわらず、わずかな欠陥を持つ実行可能か、肥沃であるノックアウトマウス、、、 –いくつかのLOFSある主張は、TRPV4-/の表現型と矛盾するように思われる。
これらの論争の一部は方法論的な起源を持っています。研究所では、異なる方法、または1つの方法のバリアントを使用し、異なる判断基準を採用する。最も一般的には、TRPV4一過 （HEK、CHO、HeLa細胞）およびアゴニストまたは低張性刺激の際、内部の[Ca 2 +]の上昇をのCa 2 +感受性蛍光染料、フラ-2に登録されている培養哺乳動物細胞で発現される。この蛍光分析上の過度の依存は、1を批判されている。異なる集団における発現レベルは、その中に分布、ならびに効果的な色素濃度は、制御され、文書化される必要がある。より信頼性の高い、直接電気生理学的検査である。これさえ、commonlなどYは、練習問題もなくもありません。個々の培養細胞における発現レベルの制御が困難であるため、全細胞電流は大きな変動を有する。電流が小さいため、さらに、信頼できる統計は、多くの場合、実用的ではない大規模なサンプルサイズ、に依存する必要があります。パッチクランプ試験はほとんど行われていない。いくつかのそのような記録は、16,17に挑戦統計的評価を行い、活動のバーストのクラスタを示しています。
よりよい分子機械的感受性を理解するためには、TRPV4を調べるために2追加のシステムを開発しました。 （1）離れて通常の哺乳類のパートナーからTRPV4を単離するために、我々は、酵母24出芽にラットTRPV4を表明している。この進化的に遠い文脈におけるTRPV4の機能的発現は、それはまだ通常のパートナーなしで、浸透力に対応できることを示した。酵母は、AAまたはEET何らPUFAを行いませんし、そのゲノムは、PLA2またはエポキシゲの遺伝子を持っていない、このexpreので、ssionはまた、TRPV4力を感知するためにそれらが必要とされないことを示している。分子生物学的に最も影響を受けやすい真核生物では、TRPV4を持つことは、効率的な順方向または逆遺伝子操作25を可能にします。 （2）TRPV4の詳細な生物物理学的な分析のために、我々はアフリカツメガエル卵母細胞においてTRPV4を表明した。 NA（10 -10〜10 -9 A）の電流にサブ-NAをもたらす培養細胞とは異なり、卵母細胞はμAの（10 -6〜10 -4 A）の電流を表現しています。ノイズの上はるかに大きい信号がより良く定量化し、より多くの自信を持って比較することができます。 TRPV4は、そのように発現され、またパッチクランプを使用して、個々の分子として調べることができる。シングル卵母細胞は再び定量化は、より信頼性の高いことが繰り返さパッチのサンプリングを可能にします。このような研究は、TRPV4チャネル自体を直接、膜延伸力14によって活性化され得ることを示した。分析はまた、14の代表的な骨格異形成対立遺伝子がすべての機能獲得型突然変異であることが示された。さらに、DEGRこの構成のCa 2 +漏れのeeは、骨格疾患23の重大匹敵する。
ため、その新規性や有用性は、これらの2つの方法の詳細な手順は、TRPV4または類似のチャネルでの今後の研究で複製を可能にするためにここに組み立てられる。
Protocol
Representative Results
Discussion
冒頭で述べたように、一般のTRPV4の機能を研究するために使用される方法は、時には矛盾し、論争となった。ここに記載された方法の二組は、いくつかの利点を提供し、既存の方法を補完することができる。我々はTRPV4でのみ研究を記載しているが、これらの方法は、他のイオンチャネルを研究するために拡張することができる。
1。酵母ルミノメトリー方法
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、優れた技術支援のためのアンドレアKremsreiterに感謝したいと思います。マディソン – 私たちの研究室での作業は、NIH GM096088とウィスコンシン大学のラース·トラストによってサポートされています。
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
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