Luminometric ושמרים<em> Xenopus</em> ביצית בחינות אלקטרו של Mechanosensitivity המולקולרי של TRPV4
Summary
כדי להשלים את השיטות נפוצות ללמוד TRPV4 של שתי שיטות מתוארות: mechanosensitivity ניתן ללמוד על ידי 2 luminometry +-aequorin Ca בשמרים מהונדסים על אתגר היפו אוסמוטי. כמו כן, ניתן לבדוק בTRPV4-RNA מוזרק ביציות Xenopus ידי מהדק כל תא שתי אלקטרודות מתח או צמד תיקון בתאים או במצב נכרת.
Abstract
TRPV4 (חלוף קולטן פוטנציאלים, משפחת vanilloid, סוג 4) באו לידי הביטוי באופן נרחב ברקמות חוליות ומופעל על ידי מספר גירויים, ובכלל זה על ידי כוחות מכאניים. מוטציות TRPV4 מסוימות לגרום לעצם תורשתי מורכב או פתולוגיות עצביות בבני אדם. transgenes Wild-type או TRPV4 המוטציה באים לידי ביטוי בדרך כלל בתאי יונקים בתרבית ונבדק על ידי הפורע-2 fluorometry ועל ידי אלקטרודות. במונחים של המנגנון mechanosensitivity והבסיסים המולקולריים של המחלות, הספרות הנוכחית היא מבלבלת ושנויה במחלוקת. כדי להשלים את השיטות קיימות, אנו מתארים שתי שיטות נוספות כדי לבחון את המאפיינים המולקולריים של TRPV4. (1) החולדה TRPV4 וtransgene aequorin הופכים שמרי ניצנים. הלם היפו osmtic מאוכלוסיית transformant תשואות אות luminometric בשל שילוב של aequorin עם Ca 2 +, שוחררה דרך ערוץ TRPV4. הנה TRPV4 מבודד מחלבונים היונקים הרגילים שלו השותףומגלה mechanosensitivity משלו. (2) קרנה של TRPV4 מוזרקת לתוך ביציות Xenopus. לאחר תקופה מתאימה של דגירה, הנוכחי TRPV4 מקרוסקופית נבחן עם מהדק מתח שתי אלקטרודות. העלייה הנוכחית עם הסרת osmoticum אינרטי מאמבטית הביצית מעידה על mechanosensitivity. זרמי microAmpere (10 -6 ל10 -4) מביציות הם הרבה יותר גדולים מאשר זרמי subnano לnanoAmpere (10 -10 ל10 -9) מהתאים בתרבית, מניב quantifications והערכות בטוחים יותר ברורים יותר. זרמים מיקרוסקופיים המשקפים את פעילותם של חלבוני ערוץ בודדים יכולים גם להיות רשומים ישירות תחת מהדק תיקון, בתאים או במצב נכרת. אותה הביצית מספקת דגימות תיקון מרובות, מאפשר שכפול נתונים טובים יותר. שאיבה להחיל תיקונים יכולה להפעיל TRPV4 להעריך mechanosensitivity ישירות. שיטות אלו צריכה להיות גם שימושיות בחקר סוגים אחרים של ערוצי TRP.
Introduction
TRPS (פוטנציאלי קולטן חולפים) מהווה שבעה subfamilies ערוצי קטיון המשרתים פונקציות חושיות 1,2. ביונקים, TRPV, תת משפחת vanilloid של TRPS, יש שישה סוגים. TRPV4 (סוג 4) 3,4 מגיב לחום, כימיקלים מסוימים, נפיחות האוסמוטי, או מאמץ גזירה. גן TRPV4 היה מבודד שוב ושוב על ידי מועמד גן ו / או ביטוי שיבוט 5-8. השיטה השנייה ואחרי התגובה של מוצר הגן להיפו אוסמולריות. TRPV4 בא לידי ביטוי כמעט בכל איברים ופונקציות בפיתוח, הפיסיולוגיה, פתולוגיה או של סוגי תאים שונים רבים 3,4.
בולט הם> 50 מוטציות TRPV4 אוטוזומלית דומיננטיות אנושי, גורם נוירופתיה היקפית ו / או dysplasias שלד (ליקויים בהתפתחות שלד) 9-11. Dysplasias השלד נע בין סוג brachyomia קל 3 (סוג 3 גמדות), סוג קוזלובסקי דיספלזיה spondylometaphyseal, לseveמחדש dysplasias, חלקם בגרימת מוות בילוד או עוברי. למרות כל הנימוסים של מנגנונים נראים אפשריים, אף מסביר את הגיוון, את המורכבות, השתנות, ומדי פעם חפיפות של מחלות אלו 4.
כמו ערוצים אחרים TRP 1, TRPV4 הוא tetramer. בחולדה או TRPV4 אדם, כל מקטע הוא כלל 871 שאריות. האלמנט המרכזי שלה הוא הטרנסממברני שישה סלילים (S1-S6), שסביר להניח שמסודרים בצורה דומה ל-K + ערוצי מתח מגודרת. שם, S1 לS4 מהווה תחום היקפי וS5 S6 ויוצרים תחום הנקבובית חלחול. בין S5 ו S6 של TRPV4 הוא סליל נקבובית קצר אחרי LDLFKLTIGMGDL הרצף, ארבעה מהם להתכנס ככל הנראה כדי ליצור את מסנן קטיון. קטע cytoplasmic N-מסוף 470 השאריות מכיל 6 חזרות ankyrin, היודע להתקשר לחלבונים או ligands הקטן. קטע cytoplasmic 152 שאריות C-המסוף כולל רצף מחייב calmodulin בין אתרים אפשריים אחרים אשר נקלטות otהאלמנטים שלה 3.
TRPV4 הוא ערוץ קטיון שלמעשה אינו כולל אניוני 1. בעוד התפקוד הפיזיולוגי שלה הוא transduce גירויים לCa 2 + זרם, הוא גם חדיר לקטיונים אחרים עם רצף חדירות אייזנמן IV, לטובת דו ערכית בCa P: P Na 7 ~ 12V. מוליכות ערוץ יחיד מתקנת ב ~ 90 PS 40 PS כלפי חוץ וכלפי פנים ~ 6,13,14. הביע Heterologously יכול להיות מופעל נוכחית (להלן) על ידי נפיחות היפו אוסמוטי, מאמץ גזירה, או חום 15. כמו כן, מופעל על ידי חומצות שומן רבות בלתי רוויות שומן 16,17 ואסתר phorbal הסינתטי 4αPDD 18. בשלב נוכחי, אגוניסט החזק ביותר הוא GSK1016790A 19 ואנטגוניסט הוא GSK2193874, יעיל ב10 -9 ל10 -8 M 20, שניהם התגלו על ידי תפוקה גבוהה, מסך קטן מולקולרי.
שני תחומים מרכזיים של מחקר TRPV4 יישארו מבלבל: (1) גם כTRPV4 נלמד במידה רבה לmechanosensitivity, הבסיס המולקולרי שלה הוא שנוי במחלוקת. מודל אחד מתאר היפו osmolarity איכשהו מפעיל פוספוליפאז A2 (PLA2) כדי לייצר את חומצת שומן רב בלתי רווי (PUFA) חומצה ארכידונית (AA), אשר מומרת epoxyeicosatrienoic חומצה (EET) על ידי epoxygenase, ואת הכריכה של EET מפעילה TRPV4 16, 17. ובכל זאת, TRPV4 עצמו הוכח להגיב ישירות לקרום למתוח 14 (להלן), ומספק הסבר פשוט יותר. (2) פתולוגיות המוטציה TRPV4 הם מבלבלים. בבסיס, צריך לדעת אם המחלות הן תוצאה של האובדן, הירידה, או העלייה של פעילות ערוץ. גם כאן, הספרות היא רחוק מלהיות ברור. בעוד אללים שלד-דיספלזיה מרובות דווחו ליש פעילות גבוהה יותר, (, GOF לזכות-of-פונקציה) 4,21, כמה דווחו לצמצם פעילות (, LOF אובדן של פונקציה) 10,22. לימוד שיטתי של 14 אללים מצא אותםכל המוטציות שGOF (להלן) 23. נראית את הטענה כי חלקם LOFs לסתור את הפנוטיפ של trpV4-/ – עכבר בנוקאאוט, שהם ברי קיימא או פורה, עם פגמים קלים בלבד, למרות אובדן תפקוד TRPV4 מלא.
חלק מהמחלוקות אלה יש מוצא מתודולוגי. מעבדות להשתמש בשיטות שונות, או גרסאות של שיטה אחת, ומעסיקות תקני שיפוט שונים. הנפוץ ביותר, TRPV4 מתבטא transiently בתאי יונקים בתרבית (HEK, CHO, הלה) והעלייה פנימי [Ca 2 +] על אגוניסט או גירוי hypotonic רשום עם Ca 2 + צבע פלואורסצנטי רגיש, הפורע-2. הסתמכות היתר על assay fluorometric זה זכתה לביקורת 1. רמת הביטוי באוכלוסיות שונות, ההפצה בו, כמו גם את ריכוז הצבע היעיל, צריכה להיות מבוקרת ומתועדת. יותר אמין הוא בדיקות אלקטרו הישירות. גם זה, כמו commonly התאמן, הוא גם לא בלי בעיות. מכיוון שרמות הביטוי בתאים בתרבית בודדות הן קשות לשליטה, יש לי כל תא זרמים וריאציות גדולות. יתר על כן, מכיוון שהזרמים קטנים, נתונים סטטיסטיים אמינים יצטרכו להסתמך על מדגמים גדולים, לעתים קרובות לא מעשיים. בדיקות תיקון מהדק רק לעתים נדירות כבר בוצעו. כמה הקלטות כאלה מראות אשכולות של פרצי פעילות שהופכים את ההערכה סטטיסטית מאתגרת 16,17.
כדי להבין טוב יותר mechanosensitivity המולקולרי, פיתחנו שתי מערכות נוספות כדי לבחון TRPV4. (1) כדי לבודד TRPV4 מהשותפים של היונקים הרגילים שלו, יש לנו הביע TRPV4 עכברוש בשמרי ניצני 24. ביטוי תפקודי של TRPV4 בהקשר אבולוציונית רחוק זה הראה שזה יכול עדיין להגיב לכוח האוסמוטי ללא שותפים הרגילים שלו. מכיוון ששמרים אינו PUFAs כגון AA או EET, ויש לו את הגנום שלו אין גנים PLA2 או epoxygenase, expre זהssion גם מראה כי הם אינם נדרשים לTRPV4 לחוש בכוח. לאחר TRPV4 באאוקריוטים ביולוגי נוחים ביותר המולקולריים גם מאפשר מניפולציות יעילים קדימה או לאחור גנטיות 25. (2) עבור ניתוחי biophysical מעמיקים של TRPV4, הבענו TRPV4 ב ביציות Xenopus. שלא כמו תאים בתרבית, אשר יניבו תת Na Na ל( 10 -10 ל10 -9) זרמים, ביצית מבטאת זרמים בμA של (10 -6 ל10 -4). אות גדולה בהרבה מעל הרעש מאפשרת כימות והשוואה בטוחה יותר טובות יותר. TRPV4, כך באו לידי ביטוי, יכול גם להיבחן כמולקולות בודדות באמצעות מהדק תיקון. ביצית אחת מאפשרת דגימת תיקון חוזר ונשנה, מה שהופך שוב כימות אמין יותר. מחקרים כאלה הראו כי ערוץ TRPV4 עצמו יכול באופן ישיר להיות מופעל על ידי כוח מתיחת קרום 14. ניתוח הראה גם כי 14 אללים שלד-דיספלזיה נציג כל מוטציות הרווח של הפונקציה. יתר על כן, degrEE של דליפה + זה מכונן Ca 2 מקביל לחומרת המחלות שלד 23.
בגלל החידוש והתועלת שלהם, הנהלים מפורטים של שתי שיטות אלה הם התאספו כאן כדי לאפשר משוכפלים במחקר עתידי על TRPV4 או ערוצים דומים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאמור במבוא, השיטות נפוצות ללמוד פונקציות TRPV4 לעתים הסתיימו בסתירות ומחלוקות. שתי קבוצות של שיטות שתוארו כאן מציעות כמה יתרונות והוא יכול להשלים את השיטות הקיימות. למרות שאנו רק לתאר מחקרים על TRPV4, השיטות ניתן להאריך ללמוד תעלות יונים אחרות גם כן.
<p class="jove_title" style=";text…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לאנדריאה Kremsreiter לקבלת סיוע טכני מעולה. עבודה במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי NIH GM096088 והאמון וילאס באוניברסיטת ויסקונסין – מדיסון.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
