Levure et luminométrique<em> Xenopus</em> ovocytes électrophysiologiques examens de la mécanosensibilité moléculaire de TRPV4
Summary
Pour compléter les méthodes couramment utilisées pour étudier TRPV4 de, deux méthodes sont décrites: Son mécanosensibilité peut être étudiée par le Ca 2 + luminométrie-aequorine dans la levure transgénique lors de l'épreuve de l'hypo-osmotique. Il peut également être consultée en TRPV4-ARN injecté des ovocytes de Xenopus par cellule entière à deux électrodes de verrouillage de tension ou de patch clamp dans la cellule ou le mode excisé.
Abstract
TRPV4 (Transient Receptor potentiels, famille vanilloid, type 4) est largement exprimée dans les tissus des vertébrés et est activée par plusieurs stimuli, y compris par des forces mécaniques. Certaines mutations de TRPV4 provoquent os héréditaire complexe ou pathologies neuronales chez l'homme. De type sauvage ou mutant TRPV4 transgènes sont souvent exprimés dans des cellules de mammifères en culture et examinés par Fura-2 fluoro et par des électrodes. En termes de mécanisme de mécanosensibilité et les bases moléculaires des maladies, la littérature actuelle est confuse et controversée. Pour compléter les méthodes existantes, nous décrivons deux méthodes supplémentaires pour examiner les propriétés moléculaires de TRPV4. (1) Rat TRPV4 et un transgène de l'aequorine sont transformées en levure bourgeonnante. Un choc de la population de transformants hypo-osmtic donne un signal de luminométrique due à la combinaison de l'aequorine avec Ca 2 +, libéré par l'intermédiaire du canal de TRPV4. Ici TRPV4 est isolé de ses protéines partenaires de mammifères habituelleset révèle sa propre mécanosensibilité. (2) l'ARNc du TRPV4 est injecté dans des ovocytes de Xenopus. Après une période d'incubation appropriée, le courant de TRPV4 macroscopique est examiné avec un voltage imposé à deux électrodes. La montée du courant lors de l'enlèvement de osmoticum inerte du bain d'ovocyte est indicative de mécanosensibilité. Les micro-ampère (10 -6 à 10 -4 A) courants de ovocytes sont beaucoup plus grandes que les subnano à nanoampère (10 -10 à 10 -9 A) courants de cellules en culture, ce qui donne quantifications plus claires et des évaluations plus confiants. Courants microscopiques reflétant les activités de protéines de canaux individuels peuvent aussi être directement enregistrés sous un patch-clamp, dans la cellule ou le mode excisée. Le même ovocyte fournit de multiples échantillons de brassage, permettant la réplication de meilleures données. Aspirateurs appliqués aux correctifs peuvent activer TRPV4 à évaluer directement mécanosensibilité. Ces méthodes devraient également être utiles dans l'étude d'autres types de canaux TRP.
Introduction
PST (potentiels de récepteurs transitoires) comprennent sept sous-familles de canaux cationiques qui remplissent des fonctions sensorielles 1,2. Chez les mammifères, TRPV, la sous-famille vanilloid de PST, a six variétés. TRPV4 (type 4) 3,4 réagit à la chaleur, certains produits chimiques, gonflement osmotique, ou contrainte de cisaillement. Le gène a été maintes fois TRPV4 isolé par candidat-gène et / ou de clonage d'expression 8.5. Cette dernière méthode suivie de la réponse du gène produit hypo-osmolarité. TRPV4 est exprimée dans presque tous les organes et les fonctions dans le développement, la physiologie, la pathologie ou de nombreux types de cellules disparates 3,4.
Frappant sont les> 50 autosomiques dominantes humaine mutations TRPV4, entraînant des neuropathies périphériques et / ou les dysplasies squelettiques (anomalies dans le développement du squelette) 9-11. Vont les dysplasies squelettiques de légère type brachyomia 3 (type 3 nanisme), la dysplasie spondylométaphysaire Type Kozlowski, de Sèvere dysplasies, certains causant la mort néonatale ou embryonnaire. Bien que toutes les manières de mécanismes semblent possibles, aucun explique la diversité, la complexité, la variabilité, et parfois des chevauchements de ces maladies 4.
Comme les autres canaux TRP 1, TRPV4 est un tétramère. Chez le rat ou TRPV4 humaine, chaque sous-unité est composée de 871 résidus. Son élément central est le six hélices transmembranaires (S1 à S6), qui sont probablement disposés d'une manière similaire à des canaux K + voltage-dépendants. Là, S1 à S4 forment un domaine périphérique et S5 et S6 forment le domaine perméation de pores. Entre S5 et S6 de TRPV4 est une hélice de pores court suivi par la séquence de LDLFKLTIGMGDL, quatre d'entre elles convergent vraisemblablement pour former le filtre de cations. Le segment cytoplasmique N-terminal de 470 résidus contient 6 répétitions ankyrine, connus pour se lier des protéines ou des petits ligands. Le segment cytoplasmique de 152 résidus C-terminale comprend une séquence liant la calmoduline parmi d'autres sites possibles qui se lient otses éléments 3.
TRPV4 est un canal cationique qui exclut essentiellement des anions 1. Bien que sa fonction physiologique est de transduire des stimuli d'influx de Ca2 +, il est également perméable à d'autres cations avec une séquence de perméabilité Eisenman IV, favorisant divalent à un P Ca: P Na ~ 7 12. Monocanal conductance rectifie à ~ 90 pS vers l'extérieur et vers l'intérieur ~ 40 pS 6,13,14. Hétérologue exprimé actuel (ci-dessous) peut être activé par une hypo-osmotique gonflement, contrainte de cisaillement, ou la chaleur 15. Il est également activé par les acides gras poly-insaturés 16,17 et l'ester synthétique phorbal 4αPDD 18. À l'heure actuelle, l'agoniste le plus puissant est GSK1016790A 19 et antagoniste est GSK2193874, efficace dans 10 -9 à 10 -8 M 20, à la fois découvert par haut débit écran, petit-moléculaire.
Deux domaines clés de la recherche TRPV4 restent confus: (1) Même si TRPV4 est largement étudié pour son mécanosensibilité, sa base moléculaire est controversée. Un modèle décrit hypo-osmolarité active en quelque sorte la phospholipase A2 (PLA2) pour produire l'acide gras polyinsaturé (AGPI) de l'acide arachidonique (AA), qui est converti en époxyeicosatriénoïques acide (EET) par une époxygénase, et la liaison des EET active TRPV4 16, 17. Pourtant, TRPV4 s'est montré à répondre directement à l'étirement de la membrane 14 (ci-dessous), en fournissant une explication plus simple. (2) Les pathologies mutantes TRPV4 sont déconcertantes. À la base, il faut savoir si les maladies sont dues à la perte, la réduction ou l'augmentation des activités de canal. Même ici, la littérature est loin d'être claire. Alors que plusieurs allèles squelettique dysplasie ont été signalés à avoir des activités plus élevés, (gain de fonction, GOF) 4,21, plusieurs auraient réduit leurs activités (perte de fonction, LOF) 10,22. Une étude systématique de 14 allèles les a trouvéstoutes les mutations être GOF (ci-dessous) 23. L'affirmation selon laquelle certains sont LOF semble contredire le phénotype de TRPV4-/ – souris knock-out, qui sont viables ou fertiles, avec seulement des défauts mineurs, en dépit d'une perte complète de la fonction TRPV4.
Une partie de ces controverses est d'origine méthodologique. Les laboratoires utilisent des méthodes différentes, ou des variantes d'une méthode, et utilisent différentes normes de jugement. Le plus souvent, TRPV4 est exprimé transitoirement dans des cellules de mammifères en culture (HEK, CHO, HeLa) et la montée de l'intérieur [Ca 2 +] sur agoniste ou stimulation hypotonique est enregistré auprès de la Ca 2 + colorant fluorescent sensible, Fura-2. Le recours excessif à ce dosage fluorimétrique a été critiquée 1. Le niveau d'expression dans les différentes populations, la distribution dans celui-ci, ainsi que la concentration de colorant efficace, doivent être contrôlés et documentés. Plus fiable est les examens électrophysiologiques directs. Même, comme commonly pratique, n'est pas non plus sans problèmes. Etant donné que les niveaux d'expression dans les cellules cultivées individuels sont difficiles à contrôler, les courants de cellules entières ont de grandes variations. En outre, parce que les courants sont faibles, des statistiques fiables devront s'appuyer sur de grands échantillons, souvent pas pratiques. Examens de patch-clamp ont rarement été effectuées. Certains de ces enregistrements montrent des grappes de salves d'activité qui font l'évaluation statistique difficile 16,17.
Pour mieux comprendre la mécanosensibilité moléculaire, nous avons développé deux systèmes supplémentaires pour examiner TRPV4. (1) Pour isoler TRPV4 loin de ses partenaires habituels de mammifères, nous avons exprimé TRPV4 rat dans la levure bourgeonnante 24. L'expression fonctionnelle de TRPV4 dans ce contexte évolutif lointain a montré qu'il pouvait encore répondre à la force osmotique sans ses partenaires habituels. Parce que la levure ne fait aucune AGPI tels que AA ou EET, et son génome a pas de gènes de PLA2 ou époxygénase, ce EXPREssion montre aussi qu'ils ne sont pas tenus pour TRPV4 pour détecter la force. Avoir TRPV4 chez les eucaryotes biologiquement mieux gérées moléculaire permet également manipulations efficace avant ou inversée génétiques 25. (2) Pour les analyses biophysiques en profondeur de TRPV4, nous avons exprimé TRPV4 dans des ovocytes de Xenopus. Contrairement aux cellules en culture, qui donnent des sous-nA nA à (10 -10 et 10 -9 A) courants, un ovocyte exprime courants dans de pA (10 -6 à 10 -4 A). Beaucoup plus grand signal sur bruit permet une meilleure quantification et la comparaison plus confiant. TRPV4, ainsi exprimée, peut également être consultée en tant que molécules individuelles à l'aide d'un patch-clamp. Un seul ovocyte permet correctif échantillonnage répété, encore une fois faire une quantification plus fiable. Ces études ont montré que TRPV4 canal lui-même peut être directement activée par la force d'étirement de la membrane 14. Les analyses ont aussi montré que 14 représentatifs allèles squelettique dysplasie sont toutes les mutations gain de fonction. En outre, le degree de ce Ca 2 + fuite constitutive est parallèle à la gravité des maladies du squelette 23.
En raison de leur nouveauté et de l'utilité, les procédures détaillées de ces deux méthodes sont réunis ici pour permettre à répétitions dans les recherches futures sur TRPV4 ou des canaux similaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme indiqué dans l'introduction, les méthodes couramment utilisées pour étudier les fonctions de TRPV4 parfois donné lieu à des incohérences et des controverses. Les deux ensembles de méthodes décrites ici offrent des avantages et peuvent compléter les méthodes existantes. Bien que nous décrivons seulement les études sur TRPV4, les méthodes peuvent être étendues à étudier d'autres canaux ioniques ainsi.
Une. Méthodes de levure luminométrie
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Andrea Kremsreiter pour une excellente assistance technique. Travail dans notre laboratoire est soutenu par le NIH et le GM096088 Vilas confiance de l'Université du Wisconsin – Madison.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
Referências
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
