Дрожжи люминометрическим и<em> Xenopus</em> ооцитов Электрофизиологические Экзамены молекулярной Mechanosensitivity из TRPV4
Summary
В дополнение к часто используемые методы для изучения TRPV4 х, два метода описаны: Его mechanosensitivity можно изучать с помощью Ca 2 +-экворин luminometry в трансгенных дрожжей при гипоосмотического вызов. Она также может быть рассмотрен в TRPV4-РНК вводили Xenopus ооциты по цельноклеточной два электрода напряжения или зажима патч зажим в режиме он-клетки или вырезали режиме.
Abstract
TRPV4 (переходных рецепторов потенциалы, ваниллоидных семьи, тип 4) широко экспрессируется в позвоночных тканей и активируется несколько стимулов, в том числе с помощью механических сил. Некоторые мутации TRPV4 вызвать сложную наследственную кость или нейронные патологии у человека. Дикого типа или мутантный TRPV4 трансгены, как правило, выражается в культивируемых клетках млекопитающих и исследовали на Fura-2 флуорометрии и на электродах. С точки зрения механизма mechanosensitivity и молекулярных основ заболеваний, в современной литературе является запутанным и противоречивым. Чтобы дополнить существующие методы, мы опишем два дополнительных метода для изучения молекулярных свойств TRPV4. (1) Крыса TRPV4 и экворин трансген превращаются в почкующихся дрожжей. Гипо-osmtic шок населения трансформированного дает сигнал люминометрическим из-за комбинации экворин с Ca 2 +, выпущенный через TRPV4 канала. Здесь TRPV4 изолирован от своих обычных млекопитающих белков-партнерови показывает свой собственный mechanosensitivity. (2) кРНК из TRPV4 вводят в Xenopus ооцитах. После соответствующего периода инкубации, макроскопический ток TRPV4 рассматривается с зажимом напряжения двух электродов. Сегодняшний рост после удаления инертного осмотикум от ооцитов ванной свидетельствует о mechanosensitivity. В микроампер (10 -6 до 10 -4) токи от ооцитов гораздо больше, чем subnano к nanoAmpere (10 -10 -10 -9) токов от культивируемых клеток, уступая более четкие количественными и увереннее оценки. Микроскопические токи, отражающие деятельность отдельных белков канала также может быть непосредственно не зарегистрированы в патч зажим, в на-клетки или вырезали режиме. То же ооцитов предоставляет несколько образцов патч, позволяющий репликацию лучше данных. Всасывает, применяемые к патчей может активировать TRPV4 непосредственным образом оценить mechanosensitivity. Эти методы также должны быть полезны при изучении других типов каналов ГТО.
Introduction
TRPs (переходные потенциалы рецепторов) состоят из семи подсемейства катионных каналов, которые служат сенсорные функции 1,2. У млекопитающих TRPV, ваниллоидных подсемейство TRPs, имеет шесть разновидностей. TRPV4 (тип 4) 3,4 реагирует на тепло, некоторые химические вещества, осмотическое набухание или напряжения сдвига. Ген TRPV4 неоднократно выделяли кандидата-гена и / или экспрессии клонирования 5-8. Последний метод следуют ответа гена продукта к гипо-осмолярности. TRPV4 выражается в почти всех органов и функций в области развития, физиологии, или патологии многих разрозненных типов клеток 3,4.
Поразительные являются> 50 человеческих аутосомно-доминантных мутаций TRPV4, вызывая периферические невропатии и / или скелетной дисплазии (аномалии в развитии скелета) 9-11. Варьироваться Скелетные дисплазии от легкой типа brachyomia 3 (тип-3 карликовость), spondylometaphyseal дисплазия типа Козловски, чтобы Севповторно дисплазии, некоторые в результате чего у новорожденных или эмбриональную смерть. Хотя все манеры механизмов представляется возможным, никто не объясняет разнообразие, сложность, изменчивость, и случайные совпадения этих заболеваний 4.
Как и другие каналы ГТО 1, TRPV4 представляет собой тетрамер. В крысы или человека TRPV4, каждый субъединицы состоит из 871 остатков. Его центральным элементом является шесть трансмембранных спиралей а (S1-S6), которые, вероятно, расположенных в аналогично напряжения закрытого К + каналов. Там, S1-S4 образуют периферийную область и S5 и S6 формируют домен проникновение пор. Между S5 и S6 TRPV4 находится в нескольких минутах спираль пор следуют LDLFKLTIGMGDL последовательности, четыре из которых предположительно сходятся, чтобы сформировать катионов фильтр. 470-остаток N-концевой цитоплазматический сегмент содержит 6 повторов анкириновых, известные связывать белки или небольшие лигандов. С-терминальная 152-остаток цитоплазматический сегмент включает последовательность калмодулина связывания среди других возможных мест, которые связывают OTее элементы 3.
TRPV4 является катионом канал, который по сути исключает анионы 1. В то время как его физиологическая функция заключается в трансдукции стимулы к Са 2 + притока, это также проницаемым для других катионов с последовательностью проницаемость Эйзенман IV, в пользу двухвалентный на P Ca: P Na ~ 7 12. Одноканальный проводимость исправляет при ~ 90 л.с. наружу и ~ 40 пСм внутрь 6,13,14. Гетерологично выразил тока (см. ниже) может быть активирован гипоосмотического отек, напряжение сдвига, или тепла 15. Он также активируется полиненасыщенных жирных кислот и 16,17 синтетический эфир phorbal 4αPDD 18. В настоящее время самым мощным агонистом является GSK1016790A 19 и антагонист GSK2193874, эффективным в 10 -9 до 10 -8 М 20, как обнаружил высокой пропускной, малого молекулярного экрана.
Два ключевых направления TRPV4 исследований остаются в заблуждение: (1) В то время как TRPV4 в значительной степени изучена его mechanosensitivity, его молекулярная основа является спорным. Одна модель описывает гипо-осмолярность как-то активирует фосфолипазу А2 (PLA2), чтобы получить полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) арахидоновой кислоты (AA), которое превращают в epoxyeicosatrienoic кислоту (EET) с помощью epoxygenase, и связывание EET активирует TRPV4 16, 17. Тем не менее, сама TRPV4 было показано, что непосредственно реагировать на мембранного участка 14 (см. ниже), что обеспечивает более простое объяснение. (2) TRPV4 мутантные патологии недоумение. В основе, необходимо знать, являются ли заболевания в связи с потерей, сокращение или увеличение деятельности канала. Даже здесь, в литературе далеко не ясно. В то время как несколько аллелей скелетно-дисплазия, как сообщалось, имеют более высокие деятельность, (прибыль-из-функции, ГОФ) 4,21, несколько, как сообщалось, сократили деятельность (с потерей функции, LOF) 10,22. Систематическое изучение 14 аллелей нашел, что онивсе будет Гоф мутации (ниже) 23. Утверждение, что некоторые из них МВУ, кажется, противоречит фенотип TRPV4-/ – нокаутом мыши, которые являются жизнеспособными или плодородная, с незначительными дефектами, несмотря на полную потерю функции TRPV4.
Часть этих противоречий имеет методологическое происхождение. Лаборатории используют различные методы, или варианты одного метода, и используют различные стандарты судейства. Чаще всего, TRPV4 временно экспрессируется в культивируемых клетках млекопитающих (НЕК, СНО, HeLa) и рост внутреннего [Ca 2 +] на агониста или гипотонического стимуляции зарегистрирован в +-чувствительного флуоресцентного красителя Ca 2, Фура-2. Чрезмерная зависимость от этого флуорометрического анализа был подвергнут критике 1. Уровень экспрессии в различных популяций, распределение в нем, а также эффективная концентрация красителя, необходимо контролировать и документированы. Надежнее прямые электрофизиологические исследования. Даже это, как commonlу практикуется, тоже не без проблем. Потому что уровни экспрессии в отдельных культурах клеток трудно контролировать, цельноклеточные токи имеют большие изменения. Кроме того, поскольку токи малы, надежные статистические данные должны будут полагаться на больших выборках, часто не практические. Патч-зажим экзамены редко выполняется. Некоторые такие записи показывают кластеры всплесков активности, которые делают статистическая оценка сложной 16,17.
Чтобы лучше понять молекулярную mechanosensitivity, мы разработали два дополнительных систем для изучения TRPV4. (1) Для выделения TRPV4 от своих обычных партнеров млекопитающих, мы выразили крысы TRPV4 у почкующихся дрожжей 24. Функциональная выражение TRPV4 в этом эволюционно далеком контексте показал, что она все еще может реагировать на осмотического силу без его обычных партнеров. Поскольку дрожжи не дает никаких ПНЖК, таких как АА или EET, и его геном не имеет PLA2 или epoxygenase гены, этот Expression также показывает, что они не требуются для TRPV4 ощутить силу. Имея TRPV4 в молекулярных биологически наиболее поддающихся эукариот также позволяет эффективно вперед или реверс-генетических манипуляций 25. (2) Для углубленных биофизических анализов TRPV4, мы выразили TRPV4 в Xenopus ооциты. В отличие от культивируемых клеток, которые дают суб-на Н. А. (10 -10 до 10 -9 А) токов, ооцитов выражает токи в мкА'S (10 -6 до 10 -4). Намного больше, сигнал над шумом позволяет лучше количественную и более уверенно сравнение. TRPV4, так выражены, также можно рассматривать как отдельных молекул с помощью патч-зажим. Один ооцитов позволяет выборки повторный патч, снова делая количественное надежнее. Такие исследования показали, что сама TRPV4 канал непосредственно может быть активирован мембрана эластичного силу 14. Анализ также показал, что 14 представительств аллели скелетно-дисплазия все мутации нарушающие функции мутации. Кроме того, градEE этого учредительного Са 2 + утечки параллельно тяжесть скелетных заболеваний 23.
Из-за их новизны и полезности, подробные процедуры этих двух методов собрались здесь, чтобы репликаций в будущих исследованиях на TRPV4 или аналогичных каналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как указано во введении, методы, обычно используемые для изучения функций TRPV4 иногда приводило к несогласованности и противоречия. Два набора методов, описанных здесь предлагают некоторые преимущества и могут дополнять существующие методы. В то время как мы описываем только исследова…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Kremsreiter за отличную техническую помощь. Работа в нашей лаборатории поддерживается NIH GM096088 и Вилас Trust университета Висконсина – Мэдисон.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
