Essai in vitro pour évaluer l'impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH
Summary
Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.
Abstract
T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l'agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l'antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l'infection par LCMV, l'administration d'anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n'existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l'impact d'un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d'échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH.
Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l'IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO 2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l'analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l'analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l'épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d'être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l'antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.
Introduction
Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d'infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l'IL-2, TNF- α et IFN-γ 1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l'IL-10, sont régulés à la hausse au cours des infections chroniques et de contribuer à un dysfonctionnement des cellules T (revue dans 3,4). Administration in vivo d'anticorps bloquants contre ces voies inhibitrices chez la souris de LCMV modèle de fonction des cellules T spécifiques du virus épuisés et amélioré la clairance virale rétablie, ce qui indique que l'épuisement de cellules T est un phénomène partiellement réversible (revue dans 5).
Conclusions sur ee modèle de LCMV ont été rapidement étendu à des infections virales chroniques humaines telles que le VHB, le VHC et le VIH 5. Dans chronique par le VIH-1 infection, PD-1 et IL-10 sont régulés à la hausse dans les voies sujets infectés et en corrélation avec les paramètres de la progression de la maladie, directement avec la charge virale et inversement proportionnelle à la numération des CD4 8.6. Blocage des anticorps PD-1 ou l'IL-10 in vitro des voies restauré la prolifération des cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH, indiquant que, comme dans le modèle de la souris LCMV, T épuisement des cellules chez l'homme est un phénomène partiellement réversible. Toutefois, en raison de la nature délicate des expériences sur des échantillons humains ainsi que les limites de la sensibilité des tests in vitro, étude approfondie des profils de restauration fonctionnelle obtenus par ces interventions est frappante absent. Les tests de prolifération ont été, jusqu'à présent, le seul test fiable in vitro testé dans la plupart des études, mais il ya un manque remarquable de preuves sur l'impact de ces interventionsinterventions sur: 1) la capacité de destruction des cellules T cytotoxiques, 2) l'effet antiviral des lymphocytes T sur la réplication virale, 3) le profil de sécrétion des cytokines, et 4) l'effet sur CD4 aide des lymphocytes T sur d'autres sous-ensembles de cellules.
Coloration intracellulaire des cytokines (ICS) est un courant très utile et largement utilisé dosage basé sur une cytométrie qui est utilisé pour détecter la production de cytokines dans divers types de cellules chez les souris et les humains. Il a également été utilisé pour étudier l'effet de l'anticorps au blocage des voies inhibitrices. Dans les dosages de l'ICS, la sécrétion de cytokines est bloquée par l'addition de Brefeldin et / ou de monensin. Les cytokines piégées à l'intérieur des cellules sont ensuite détectés avec des anticorps fluorescents en utilisant la cytométrie en flux polychromatique. La durée de l'essai est généralement limité à 6 ou 12 h après la stimulation antigénique puisque les deux Brefeldin et monensine, qui sont typiquement ajoutés en 2 heures de l'addition de l'antigène, sont toxiques pour les cellules. Le dosage des ICS est une technique puissante qui a été i utilesn l'investigation de l'effet de l'administration in vivo d'anticorps de blocage intervention chez les souris où les cellules ont été extraites, après une certaine période de temps après l'exposition de l'anticorps 9. Cependant, il existe plusieurs limitations à l'application de cette approche expérimentale pour évaluer l'impact de blocage des récepteurs inhibiteurs dans les échantillons humains. Lors d'interventions d'anticorps de voies inhibitrices dans une stimulation 6 ou 12 heures in vitro (typiquement le cas avec des échantillons humains), le blocage des récepteurs inhibiteurs dans la plupart des cas, ne modifie pas la fréquence de la réponse des cellules T spécifiques de l'antigène, mesurée par des dosages de l'ICS standards 6, 7. Les mesures de la production de cytokines par des cellules, mesurée par l'intensité moyenne ou la médiane de fluorescence ont donné des résultats incohérents 6, 7, 10. D'autre part, lorsque ICS est effectuée à un point de temps après la fin de la stimulation (par exemple six jours), les changements dans le nombre de cytokine sécrétant caunes peuvent être observées. Les différences sont un effet combiné de la prolifération altérée, la survie et l'évolution de la fonction d'effecteur qui s'accumulent au cours de la période de temps spécifiée 6. Une façon de surmonter une partie de ces limitations est à incuber pendant de longues périodes de temps (par exemple 36 h, 60 h, etc.) Avec l'antigène avant l'ajout de l'inhibiteur de sécrétion des cytokines sans attendre à la prolifération de se produire. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour déterminer la cinétique de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH 11,12, mais cette approche n'est pas en mesure de détecter des réponses petites et ne donnera pas un résultat intégré de la sécrétion de cytokine totale survenant car la stimulation. Par conséquent, ICS n'est pas une méthode suffisamment sensible pour détecter l'impact de blocage des voies inhibitrices de la quantité de cytokines produites par les cellules T activées par rapport à la quantification de l'ARNm de cytokines ou des mesures de la sécrétion de cytokines dans le supernatant aux mêmes points dans le temps. En outre, la plupart des cytokines produites par les lymphocytes T activés agissent de façon autocrine, en contribuant à la rétroaction positive ou négative par une interaction avec des boucles de cellules présentatrices d'antigène. Par conséquent, l'addition de Brefeldin monensin ou au cours de l'essai de ICS empêche la sécrétion de cytokines et donc la stimulation des cellules T n'est pas optimale. Enfin, la détection de multiples cytokines avec ICS est limitée par la disponibilité d'anticorps et de la sensibilité pour la détection des cytokines avec la cytométrie de flux, ainsi que par des contraintes dans le nombre des fluorochromes qui peuvent être utilisés simultanément dans n'importe quel panneau donné.
Nous avons développé une approche très sensible in vitro expérimentale pour évaluer l'impact des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH et par la suite CD4 aide à cellules présentatrices d'antigène (CPA) et les cellules tueuses naturelles (cellules NK). Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer l'impact de blocus de molécules inhibitrices de la fonction des cellules T CD8 par épuiser les cellules de PBMC T CD4 ou en stimulant des peptides optimales reconnues uniquement par les cellules T CD8. Contrairement à intracellulaires dosages de cytokines de coloration, nous avons décidé de ne pas interférer avec la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH afin d'être en mesure de: 1) réaliser une quantification plus précise des niveaux de cytokines produites; 2) étudier un panel plus large des cytokines ou des molécules effectrices, et 3) évaluer l'impact de cytokines produites par les cellules T CD4 spécifiques du VIH sur les autres sous-ensembles de cellules. On stimule CD8 PBMC déplétées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide, en présence d'anticorps bloquants pour la voie immunorégulateur d'intérêt. Après le temps désiré d'incubation, généralement 48 heures, nous recueillons les surnageants de mesurer la sécrétion de cytokines avec des tableaux de perles et de recueillir les culots cellulaires soit pour l'analyse phénotypique des différents sous-ensembles de cellules ou pour l'analyse de la transcription. De noter, à tson article 48, point de temps h, on ne détecte pas une population significative de la prolifération des cellules T 12. Il s'agit d'une approche souple et plusieurs adaptations de cette conception peut être appliquée pour répondre à différentes hypothèses. Par exemple, les sous-ensembles de cellules individuelles (telles que des cellules T CD4 spécifiques du VIH ou de PD-1 des cellules de haute T CD4, etc.) Peuvent être triées après 12 h d'incubation avant incubation supplémentaire pendant 36 heures puis on a recueilli les surnageants et les culots de cellules d'enquêter plus spécifiquement l'impact des interventions du blocus sur la sécrétion de cytokines par les sous-populations définies de CMSP.
Protocol
Representative Results
Discussion
collecte de surnageant est une composante essentielle de cette conception expérimentale. Lors de la récolte des surnageants pour l'analyse Luminex, des aliquotes ont été établis et conservés à -80 ° C pour éviter la dégradation des protéines en raison de cycles gel-dégel. La congélation et la décongélation peut être processus rigoureux pour les protéines, et en minimisant gel-dégel, le signal sera maximisé dans les essais. Par conséquent, il est plus facile d'obtenir des données plus précis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Gordon Freeman pour fournir l'anticorps bloquant anti-PD-L1. Nous remercions le personnel clinique et de laboratoire à l'Hôpital général du Massachusetts et tous les participants à l'étude pour leur rôle inestimable dans ce projet.
Cette étude a été financée par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health (SP1 AI-080192; DEK), le coeur-poumon National and Blood Institute des National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK est soutenu par une bourse de carrière bourse de recherche du Fonds de recherche en santé du Québec (FRQS). FP est soutenu par une subvention de la communion de l'Assemblée générale Comité exécutif Hôpital Massachusetts sur la recherche et le Global Health Institute de Harvard (HGHI).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referências
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