In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten
Summary
Wir entwickelten ein in vitro Assay, um die Rolle von immunWege in der Regulation der Zytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen zu untersuchen.
Abstract
T-Zell-Erschöpfung ist ein wichtiger Faktor in gescheiterten Erreger Freiheit während der chronischen Virusinfektionen. Immunwege, wie PD-1 und IL-10 sind bei dieser laufenden Antigenexposition hochreguliert und tragen zum Verlust von Proliferation, cytolytische Funktion reduziert und durch CD4-und CD8-T-Zellen-Cytokinproduktion beeinträchtigt. Im Mausmodell der LCMV-Infektion, die Verwaltung der blockierenden Antikörper gegen diese beiden Wege erweitert T-Zellantworten. Allerdings gibt es noch keine in vitro Assay, um die Auswirkungen dieser Blockade Zytokinsekretion in Zellen aus menschlichen Proben zu messen. Unser Protokoll und experimentellen Ansatz ermöglichen es uns, genau und effizient zu quantifizieren, die Wiederherstellung der Zytokin-Produktion von HIV-spezifischen CD4-T-Zellen von HIV-infizierten Patienten.
Hier wird ein in vitro-Versuchsanordnung, die Messungen der Cytokin-Sekretion kann durch HIV-spezifische CD4 + T-Zellen und deren Auswirkungen auf andere cel zeigen wirl Teilmengen. CD8-T-Zellen wurden aus Vollblut erschöpft und Rest PBMCs wurden über Ficoll-Trennverfahren isoliert. CD8-abgereicherten PBMC wurden dann mit blockierenden Antikörpern gegen PD-L1 und / oder IL-10Rα und nach Stimulation mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool wurden die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert. Nach 48 Stunden Überstand wurde für die Zytokin-Analyse durch Perlen-Arrays und Zellpellets gesammelt wurden, entweder für phänotypische Analyse mittels Durchflusszytometrie oder Transkriptionsanalyse mittels qRT-PCR gesammelt. Für weitere detaillierte Analyse wurden verschiedene Zellpopulationen durch selektive Depletion Teilmenge aus PBMCs oder durch Sortieren mit Durchflusszytometrie, bevor sie in den gleichen Tests untersucht erhalten. Diese Verfahren stellen eine sehr empfindliche und spezifische Ansatz zur Modulation der Cytokin-Produktion durch Antigen-spezifische T-Helferzellen zu bestimmen und funktionellen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Populationen von Immunzellen zu bestimmen.
Introduction
Während der anhaltenden viralen Infektionen, Virus-spezifischen T-Zellen-erwerben Funktionsstörungen in einem Prozess als T-Zell-Erschöpfung bekannt. Früh in-vivo-Studien im murinen Modell der LCMV chronische Virusinfektion angegeben, dass erschöpft Virus-spezifische T-Zellen gegen zytolytische Funktion viral infizierte Zellen reduziert, verlieren ihre Fähigkeit zu vermehren und haben Fähigkeit, Zytokine wie IL-2, TNF-produzieren reduziert α und IFN-γ 1,2. Ein komplexes Netzwerk von immunWege, wie PD-1 und IL-10, während chronische Infektionen hochreguliert und zur T-Zell-Funktionsstörung (in 3,4 bewertet). In vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörpern gegen diese hemmenden Bahnen in der LCMV-Maus Modell restauriert Funktion erschöpft virusspezifischen T-Zellen und eine verbesserte Virenfreiheit, die anzeigt, dass T-Zell-Erschöpfung ist ein Phänomen teilweise reversibel (in 5 Bewertung).
Erkenntnisse über thE LCMV-Modell wurden schnell die menschliche chronische Virusinfektionen wie HBV, HCV und HIV 5 verlängert. Bei der chronischen HIV-1-Infektion, sind PD-1 und IL-10 Wege in infizierten Patienten hochreguliert und korrelieren mit den Parametern der Krankheitsprogression, direkt mit der Viruslast und umgekehrt mit der CD4-Zellzahl 6-8. Antikörper Blockade der PD-1 oder IL-10 in vitro Wege wiederhergestellt Proliferation von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen, was anzeigt, dass, ähnlich der LCMV-Maus-Modell, ist T-Zell-Erschöpfung bei Menschen eine teilweise reversible Phänomen. Aufgrund der empfindlichen Natur von Experimenten an menschlichen Proben sowie Einschränkungen in der Empfindlichkeit der in-vitro-Assays, gründliche Untersuchung der funktionellen Wiederherstellung von Profilen dieser Interventionen erreicht wird, ist jedoch auffallend abwesend. Proliferationsassays wurden, so weit, die einzige zuverlässige in-vitro-Test in den meisten Studien getestet, aber es ist ein bemerkenswerter Mangel an Beweisen über die Auswirkungen dieser interInterventionen auf: 1) die Tötung Kapazität von zytotoxischen T-Zellen, 2) die antivirale Wirkung von T-Zellen auf die virale Replikation, 3) die Zytokinsekretion Profil und 4) die Wirkung auf CD4-T-Zell-Hilfe für andere Zell-Untergruppen.
Intrazelluläre Cytokin-Färbung (ICS) ist eine sehr nützliche und weit verbreitet Durchflusszytometrie basierenden Assay, der verwendet wird, um die Produktion von Zytokinen in verschiedenen Zelltypen sowohl in Mäusen und Menschen zu erkennen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung der Antikörperblockade hemmenden Bahnen zu untersuchen. In ICS Assays wird Zytokinsekretion durch Zugabe von Brefeldin und / oder Monensin blockiert. Zytokine in den Zellen eingeschlossen werden dann mit fluoreszierenden Antikörpern mit polychromatischen Durchflusszytometrie detektiert. Die Dauer des Tests wird in der Regel 6 oder 12 Stunden nach der Antigen-Stimulation beschränkt, da sowohl Brefeldin und Monensin, die typischerweise innerhalb von 2 h von Antigen Zugabe zugegeben werden, sind für die Zellen toxisch. Das ICS-Assay ist eine leistungsfähige Technik, die sich als nützlich erwiesen hat in die Untersuchung der Wirkung der in vivo-Verabreichung von blockierenden Antikörper Eingriff mit Mäusen, wurden die Zellen nach einer gewissen Zeit nach der Antikörper-Belichtungs 9 extrahiert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen bei der Anwendung dieser experimentellen Ansatz, die Auswirkungen der Blockade der inhibitorischen Rezeptoren im menschlichen Proben auszuwerten. Bei der Durchführung von Antikörper Eingriffe hemmenden Bahnen in einer 6 oder 12 h in-vitro-Stimulation (typischerweise der Fall bei humanen Proben), wird die Blockade der hemmenden Rezeptoren in den meisten Fällen die Frequenz reagiert Antigen-spezifischen T-Zellen nicht zu ändern, wie durch Standardassays gemessen ICS 6, 7. Messungen pro Zelle Zytokinproduktion durch Mittelwert oder Median der Fluoreszenzintensität gemessen, haben widersprüchliche Ergebnisse 6, 7, 10 angegeben. Andererseits, wenn ICS zu einem späten Zeitpunkt nach der Stimulierung durchgeführt (dh 6 Tage), Veränderungen in der Anzahl der Cytokin-sezer cEllen beobachtet werden. Die Unterschiede sind ein kombinierter Effekt der veränderten Proliferation, das Überleben und Veränderungen in Effektor-Funktion, die über den angegebenen Zeitraum 6 ansammeln. Eine Möglichkeit, diese Beschränkungen teilweise zu überwinden, ist für längere Zeiträume (z. B. 36 h, 60 h, etc.) Mit dem Antigen vor der Zugabe der Zytokinsekretion Blocker, ohne auf die Proliferation auftritt inkubieren. Wir haben erfolgreich diese Methode verwendet, um die Kinetik der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4-und CD8-T-Zellen zu bestimmen, 11,12, jedoch ist dieser Ansatz nicht in der Lage, kleine Antworten detektieren und ein integriertes Ergebnis die Gesamt Zytokinsekretion vorkommenden nicht geben seit Stimulation. Daher ist ICS nicht ausreichend empfindliches Verfahren, um die Auswirkungen der Blockade der hemmenden Bahnen auf der Anzahl von Zytokinen durch aktivierte T-Zellen produziert, verglichen mit Zytokin-mRNA-Quantifizierung oder Messungen der Cytokin-Sekretion im supernatan erkennent in den gleichen Zeitpunkten. Zusätzlich wirken die meisten der von aktivierten T-Zellen produzierten Zytokine in autokriner Weise durch einen Beitrag zur positiven oder negativen Rückkopplungsschleifen durch die Interaktion mit Antigen-präsentierenden Zellen. Daher Zugabe von Monensin oder Brefeldin im ICS Assay verhindert Zytokinsekretion und somit Stimulation von T-Zellen nicht optimal ist. Schließlich wird die Detektion von mehreren Cytokinen mit ICS durch die Verfügbarkeit und die Empfindlichkeit der Antikörper zum Nachweis von Zytokinen mit Durchflusszytometrie als auch durch Beschränkungen in der Anzahl von Fluorochromen, die gleichzeitig in einem gegebenen Panel verwendet werden können, begrenzt.
Wir entwickelten ein hochempfindliches in vitro-Versuchsansatz, um die Auswirkungen von immun Wege der Regulierung der Zytokinsekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen und CD4 Hilfe anschließend auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zu bewerten. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die impa evaluierenct Blockade von inhibitorischen Moleküle auf CD8-T-Zellfunktion durch abbau die CD4-T-Zellen aus PBMCs oder durch Stimulation mit optimalen Peptide, die nur von CD8-T-Zellen erkannt werden. Im Gegensatz zu intrazellulären Zytokinfärbung Assays haben wir beschlossen, nicht mit der Cytokin-Sekretion von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen, um in der Lage zu sein, beeinträchtigt: 1) führen eine genauere Quantifizierung der produzierten Zytokinspiegel, 2) Untersuchung eine breitere Platte von Cytokinen oder Effektormoleküle, und 3) die Auswirkungen von von HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen auf andere Zellen-Untergruppen produzierten Zytokine. Wir stimulieren CD8 abgereicherten PBMC mit einem HIV-1-Gag-Peptid-Pool in Gegenwart von blockierenden Antikörpern für die immun Weg von Interesse. Nach der gewünschten Inkubationszeit, in der Regel 48 Stunden, sammeln wir die Überstände Zytokinsekretion mit Perlenanordnungen messen und sammeln die Zellpellets entweder für phänotypische Analyse der verschiedenen Zelluntergruppen oder für die Transkriptionsanalyse. Von beachten Sie, dass bei tseine 48 h Zeitpunkt haben wir nicht eine bedeutende Population von proliferierenden T-Zellen 12 zu erfassen. Dies ist ein flexibler Ansatz und mehrere Anpassungen dieser Konstruktion kann angewendet werden, um verschiedene Hypothesen zu adressieren. Zum Beispiel können die einzelnen Zelluntergruppen (z. B. HIV-spezifischen CD4 + T-Zellen oder PD-1 Hoch CD4-T-Zellen, etc..) Nach 12 h Inkubation vor der weiteren Inkubation für 36 Stunden, gefolgt vom Sammeln der Überstände und Zellpellets sortiert um genauer zu untersuchen die Auswirkungen der Blockade auf Interventionen Zytokinsekretion durch definierte Subpopulationen von PBMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Überstand Sammlung ist ein Imperativ Teil dieser experimentellen Design. Bei der Ernte der Überstände zur Luminex-Assay wurden Aliquote hergestellt und bei -80 ° C gehalten, um den Proteinabbau durch Zyklen Einfrieren-Auftauen zu verhindern. Einfrieren und Auftauen kann hart Verfahren für Proteine und durch Gefrier taut minimiert sein, werden in Tests Signal maximiert werden. Daher ist es einfacher, wiederholbare und genaue Daten beim Arbeiten von Aliquots, die gefriertaut die gleiche Anzahl von Zeiten zu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Gordon Freeman für die Bereitstellung des anti-PD-L1 blockierenden Antikörpers. Wir danken der klinischen und Laborpersonal am Massachusetts General Hospital und allen Studienteilnehmern für ihre unschätzbare Rolle in diesem Projekt.
, National Heart Lung and Blood Institute der National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK) Diese Studie wurde durch das Nationale Institut für Allergie und Infektionskrankheiten der National Institutes of Health (DEK PA1 AI-080192) gefördert. DEK ist von einem Research Scholar Career Award der Quebec Health Research Fund (FRQS) unterstützt. FP wird durch ein Stipendium Erteilung des Massachusetts General Hospital Vorstand für Forschung und der Harvard Global Health Institute (HGHI) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referências
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