इन विट्रो परख में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी सेल effector समारोह पर immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए
Summary
हम एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव के नियमन में immunoregulatory रास्ते की भूमिका की जांच के लिए इन विट्रो परख विकसित की है.
Abstract
टी सेल थकावट क्रोनिक वायरल संक्रमण के दौरान विफल रोगज़नक़ निकासी में एक प्रमुख कारक है. ऐसे पीडी -1 और आईएल -10 के रूप में immunoregulatory रास्ते, चल रहे इस प्रतिजन जोखिम पर upregulated और प्रसार की कमी, कम cytolytic समारोह में योगदान है, और CD4 और CD8 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन प्रभावित कर रहे हैं. LCMV संक्रमण की murine मॉडल में, टी सेल प्रतिक्रिया संवर्धित इन दो रास्ते खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध का प्रशासन. बहरहाल, मानव नमूनों से कोशिकाओं में cytokine स्राव पर ऐसी नाकाबंदी के प्रभाव को मापने के लिए कोई इन विट्रो परख वर्तमान में है. हमारे प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सही और कुशलता से एचआईवी संक्रमित विषयों से एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन की बहाली यों करने के लिए सक्षम.
यहाँ, हम एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं और अन्य सेल पर उनके प्रभाव से cytokine स्राव की माप सक्षम बनाता है कि इन विट्रो में एक प्रयोगात्मक डिजाइन को दर्शातीएल कैंपेन्स. CD8 टी कोशिकाओं पूरे रक्त से समाप्त हो रहे थे और शेष PBMCs Ficoll जुदाई विधि के माध्यम से अलग थे. सीडी 8 समाप्त PBMCs तो एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर incubated रहे थे, पी.डी. एल 1 और / या आईएल 10Rα खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध और साथ incubated रहे थे. 48 घंटा, सतह पर तैरनेवाला मोती सरणियों और सेल छर्रों से साइटोकाइन विश्लेषण के लिए एकत्र किया गया था के बाद QRT-पीसीआर का उपयोग cytometry या ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण प्रवाह का उपयोग कर प्ररूपी विश्लेषण के लिए या तो एकत्र किए गए थे. अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, अलग सेल आबादी PBMCs से चयनात्मक सबसेट कमी से या एक ही assays में मूल्यांकन किया जा रहा से पहले प्रवाह cytometry का उपयोग छँटाई के द्वारा प्राप्त किया गया. इन विधियों प्रतिजन विशेष टी सहायक कोशिकाओं द्वारा cytokine उत्पादन की मॉडुलन निर्धारित करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के बीच कार्यात्मक बातचीत निर्धारित करने के लिए एक बेहद संवेदनशील और विशिष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.
Introduction
लगातार वायरल संक्रमण के दौरान, वायरस विशिष्ट-टी कोशिकाओं टी सेल थकावट के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में कार्यात्मक दोष हासिल. प्रारंभिक क्रोनिक वायरल संक्रमण के murine LCMV मॉडल में vivo अध्ययन में समाप्त वायरस विशेष टी कोशिकाओं, virally संक्रमित कोशिकाओं के खिलाफ cytolytic समारोह कम पैदा करना करने की क्षमता खो देते हैं और इस तरह के आईएल -2, TNF-के रूप में साइटोकिन्स का उत्पादन करने की क्षमता को कम कर दिया है कि संकेत α और 1,2 IFN-γ. ऐसे पीडी -1 और आईएल -10 के रूप में immunoregulatory रास्ते में से एक जटिल नेटवर्क, पुराने संक्रमण के दौरान upregulated और (3,4 में समीक्षा) टी सेल रोग के लिए योगदान कर रहे हैं. में LCMV माउस में इन निरोधात्मक रास्ते खिलाफ एंटीबॉडी अवरुद्ध की विवो प्रशासन मॉडल टी सेल थकावट (5 में समीक्षा) एक आंशिक रूप से प्रतिवर्ती घटना का संकेत है कि, थक वायरस विशेष टी कोशिकाओं के समारोह और बढ़ाया वायरल निकासी बहाल.
वें पर निष्कर्षई LCMV मॉडल जल्दी से ऐसे एचबीवी, HCV और एचआईवी 5 के रूप में मानव क्रोनिक वायरल संक्रमण के लिए बढ़ा दिया गया. पुरानी एचआईवी -1 संक्रमण में, पीडी -1 और आईएल -10 रास्ते संक्रमित विषयों में upregulated हैं और सीडी 4 के साथ विपरीत रूप से वायरल लोड और साथ सीधे, रोग प्रगति के मानकों के साथ सहसंबंधी 6-8 गिनती. LCMV माउस मॉडल के समान, मानव में टी सेल थकावट एक आंशिक रूप से प्रतिवर्ती घटना है, यह दर्शाता है कि एचआईवी विशिष्ट CD4 और CD8 टी कोशिकाओं की इन विट्रो बहाल प्रसार में पीडी -1 या आईएल -10 रास्ते में से एंटीबॉडी नाकाबंदी. हालांकि, नाजुक मानव नमूनों पर प्रयोग की प्रकृति के साथ ही इन विट्रो assays, इन उपायों से हासिल कार्यात्मक बहाली प्रोफाइल के पूरी तरह से जांच की संवेदनशीलता में सीमाओं की वजह से ऊँची अनुपस्थित है. प्रसार assays, अब तक, सबसे अध्ययन में परीक्षण केवल विश्वसनीय में इन विट्रो परख कर दिया गया है, अभी तक इन अंतर के प्रभाव पर सबूत का एक उल्लेखनीय कमी हैपर ventions: साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं की 1) हत्या क्षमता, 2) वायरल प्रतिकृति पर टी कोशिकाओं की antiviral प्रभाव, 3) cytokine स्राव प्रोफाइल, और अन्य सेल सबसेट पर सीडी 4 टी सेल की मदद पर 4) प्रभाव.
Intracellular साइटोकाइन धुंधला (आईसीएस) एक बहुत ही उपयोगी और व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रवाह दोनों चूहों और इंसानों में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में साइटोकिन्स का उत्पादन का पता लगाने के लिए किया जाता है कि cytometry आधारित परख है. यह भी निरोधात्मक रास्ते में से एंटीबॉडी नाकाबंदी के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आईसीएस assays में cytokine स्राव Brefeldin और / या Monensin के अलावा द्वारा अवरुद्ध है. कोशिकाओं के अंदर फंस साइटोकिन्स तो अनेक रंगों फ्लो का उपयोग फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ पाया जाता है. आम तौर पर प्रतिजन अलावा 2 घंटा के भीतर जोड़ रहे हैं जो Brefeldin और Monensin, दोनों कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं के बाद से परख की अवधि आमतौर पर प्रतिजन उत्तेजना के बाद 6 या 12 घंटे तक ही सीमित है. आईसीएस परख उपयोगी मैं कर दिया गया है कि एक शक्तिशाली तकनीक हैn कोशिकाओं एंटीबॉडी जोखिम 9 के बाद समय की एक निश्चित अवधि के बाद निकाले गए थे जहाँ चूहों में एंटीबॉडी हस्तक्षेप ब्लॉकिंग के vivo प्रशासन के प्रभाव की जांच. बहरहाल, मानव नमूनों में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की नाकाबंदी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के आवेदन के लिए कई सीमाएं हैं. इन विट्रो में एक 6 या 12 घंटा उत्तेजना (मानव नमूनों के साथ आम तौर पर मामले) में निरोधात्मक रास्ते में से एंटीबॉडी हस्तक्षेप करते समय मानक आईसीएस assays के द्वारा मापा के रूप में, ज्यादातर मामलों में निरोधात्मक रिसेप्टर्स की नाकाबंदी प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं जवाब की आवृत्ति को बदल नहीं है 6, 7. मतलब या मंझला प्रतिदीप्ति तीव्रता से मापा के रूप में प्रति सेल cytokine उत्पादन की माप असंगत परिणाम 6, 7, 10 दे दिया है. दूसरी ओर, आईसीएस के बाद एक देर समय बिंदु पर किया जाता है जब उत्तेजना (यानी छह दिन), साइटोकाइन स्रावित ग की संख्या में परिवर्तनएल्स मनाया जा सकता है. मतभेद बदल प्रसार, अस्तित्व, और समय 6 की निर्धारित अवधि में जमा कि effector समारोह में परिवर्तन का एक संयुक्त प्रभाव हैं. आंशिक रूप से इन सीमाओं को पार करने के लिए एक तरह से प्रसार होने के लिए इंतजार कर के बिना cytokine स्राव अवरोधक के अलावा पहले प्रतिजन साथ समय की लंबी अवधि (जैसे 36 घंटा, 60 घंटा, आदि.) के लिए सेते है. हम सफलतापूर्वक एचआईवी विशिष्ट CD4 और CD8 टी कोशिकाओं 11,12 द्वारा cytokine स्राव के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है, लेकिन, इस दृष्टिकोण छोटे प्रतिक्रियाओं पता लगाने में सक्षम नहीं है और कुल cytokine स्राव होने वाली एक एकीकृत परिणाम नहीं देंगे उत्तेजना के बाद से. इसलिए, आईसीएस supernatan में साइटोकाइन mRNA quantitation या cytokine स्राव की माप के साथ तुलना में सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स की मात्रा पर निरोधात्मक रास्ते की नाकाबंदी के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील पर्याप्त विधि नहीं हैएक ही समय बिंदुओं पर टी. इसके अतिरिक्त, सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स का सबसे सकारात्मक या नकारात्मक प्रतिक्रिया करने के लिए योगदान करके autocrine फैशन में अभिनय प्रतिजन कोशिकाओं के साथ बातचीत के माध्यम से छोरों. इसलिए, आईसीएस परख के दौरान Brefeldin या Monensin के अलावा cytokine स्राव को रोकता है और इस तरह टी कोशिकाओं की उत्तेजना इष्टतम नहीं है. अंत में, आईसीएस के साथ कई साइटोकिन्स का पता लगाने के प्रवाह cytometry साथ साइटोकिन्स का पता लगाने के साथ ही किसी भी पैनल में एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि fluorochromes की संख्या में कमी के द्वारा की उपलब्धता और एंटीबॉडी की संवेदनशीलता के द्वारा सीमित है.
हम कोशिकाओं (APCs) और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के. कोशिकाओं) पेश प्रतिजन के लिए एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव को विनियमित करने और बाद में सीडी 4 मदद में immunoregulatory रास्ते के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक बेहद संवेदनशील इन विट्रो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किया है. यह विधि भी IMPA मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैPBMCs से सीडी 4 टी कोशिकाओं घट द्वारा या केवल CD8 टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त हैं कि इष्टतम पेप्टाइड्स के साथ उत्तेजक द्वारा CD8 टी सेल समारोह पर निरोधात्मक अणुओं की नाकाबंदी की सीटी. , 2) एक व्यापक पैनल की जांच 1) उत्पादित साइटोकाइन के स्तर का एक और अधिक सटीक मात्रा का ठहराव प्रदर्शन: intracellular साइटोकाइन धुंधला assays के विपरीत, हम करने के लिए सक्षम होने के लिए आदेश में एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं द्वारा cytokine स्राव के साथ हस्तक्षेप नहीं करने का फैसला साइटोकिन्स या प्रेरक अणुओं की, और 3) अन्य सेल सबसेट पर एचआईवी विशिष्ट CD4 टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स के प्रभाव का मूल्यांकन. हम ब्याज की immunoregulatory मार्ग के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध की उपस्थिति में एक एचआईवी -1 चुप पेप्टाइड पूल के साथ सीडी 8 समाप्त हो PBMCs को प्रोत्साहित. ऊष्मायन, आमतौर पर 48 घंटे की यात्रा के समय के बाद, हम मनका सरणियों साथ cytokine स्राव को मापने और अलग सेल सबसेट के प्ररूपी विश्लेषण के लिए या ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए या तो सेल छर्रों इकट्ठा करने के लिए supernatants इकट्ठा. टी पर ध्यान देंउसकी 48 घंटा समय बिंदु, हम टी कोशिकाओं 12 proliferating का एक महत्वपूर्ण आबादी का पता नहीं लगा. यह एक लचीला दृष्टिकोण है और इस डिजाइन के कई रूपांतरों विभिन्न परिकल्पनाओं को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, (जैसे एचआईवी विशिष्ट सीडी 4 टी कोशिकाओं या पीडी -1 उच्च सीडी 4 टी कोशिकाओं के रूप में.) व्यक्तिगत सेल सबसेट supernatants और सेल छर्रों का संग्रह द्वारा पीछा किया 36 घंटे के लिए आगे ऊष्मायन से पहले ऊष्मायन के 12 घंटे के बाद हल किया जा सकता है अधिक विशेष रूप से PBMCs के परिभाषित subpopulations द्वारा cytokine स्राव पर नाकाबंदी के उपायों के प्रभाव की जांच करने के लिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
सतह पर तैरनेवाला संग्रह इस प्रयोगात्मक डिजाइन का एक अनिवार्य हिस्सा है. Luminex परख के लिए supernatants कटाई करते हैं, aliquots बनाया और चक्र पिघलना फ्रीज की वजह से प्रोटीन गिरावट को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विरोधी पी.डी. एल 1 अवरुद्ध एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए गॉर्डन Freeman धन्यवाद. हम मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल और इस परियोजना में उनके अमूल्य भूमिका के लिए सभी अध्ययन प्रतिभागियों में नैदानिक और प्रयोगशाला स्टाफ को धन्यवाद.
राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान (RO1 एच. एल-092565, DEK) है, यह अध्ययन नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (DEK PO1 एआई 080192) के संक्रामक रोगों ने सहारा दिया. DEK क्यूबेक स्वास्थ्य अनुसंधान कोष की एक रिसर्च स्कॉलर कैरियर पुरस्कार (FRQS) द्वारा समर्थित है. एफपी अनुसंधान और हार्वर्ड विश्व स्वास्थ्य संस्थान (HGHI) पर मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल के कार्यकारी समिति के एक फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referências
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