In Vitro analysen å evaluere virkningen av immunoregulatory Pathways på HIV-spesifikke CD4 T Cell effektorfunksjon
Summary
Vi har utviklet en in vitro-analyse for å undersøke rollen til immunoregulatoriske baner i regulering av cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler.
Abstract
T celle utmattelse er en viktig faktor i sviktet patogen klaring under kroniske virusinfeksjoner. Immunoregulatoriske baner, for eksempel PD-1 og IL-10, blir oppregulert ved denne pågående antigen eksponering og bidra til tap av proliferasjon, redusert cytolytisk funksjon, og svekket cytokin produksjon av CD4 og CD8 T-celler. I murine modell av LCMV infeksjon, administrasjon av blokkerer antistoffer mot disse to banene utvidet T celle responser. Men det er ikke noe in vitro assay for å måle effekten av en slik blokade på cytokin sekresjon i celler fra humane prøver. Vår protokoll og eksperimentell tilnærming gjør oss i stand til å nøyaktig og effektivt kvantifisere restaurering av cytokin produksjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler fra HIV-infiserte forsøkspersoner.
Her, vi skildre en in vitro eksperimentell design som gjør målinger av cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler og deres innvirkning på andre cell undergrupper. CD8 T-cellene ble fjernet fra fullblod, og de resterende PBMC ble isolert via Ficoll separasjonsmetode. CD8-fratatte PBMC ble deretter inkubert med blokkerende antistoffer mot PD-L1 og / eller IL-10Rα og etter stimulering med en HIV-1 Gag peptid basseng, ble celler inkubert ved 37 ° C, 5% CO2. Etter 48 timer, supernatant ble samlet inn for cytokin analyse av perler arrays og celle pellets ble samlet for enten fenotypeanalyser ved hjelp av flowcytometri eller transcriptional analyse ved hjelp QRT-PCR. For mer detaljert analyse, ble ulike cellepopulasjoner oppnås ved selektiv undergruppe uttømming fra PBMCs eller ved å sortere ved hjelp av flowcytometri før de blir vurdert i de samme analysene. Disse metodene gir en meget følsom og spesifikk metode for å bestemme moduleringen av cytokin produksjon av antigen-spesifikke T-hjelperceller, og for å bestemme funksjonelle interaksjoner mellom forskjellige populasjoner av immunceller.
Introduction
Under vedvarende virusinfeksjoner, virusspesifikk-T-celler skaffe funksjonelle defekter i en prosess kjent som T-celle-uttømming. Tidlig in vivo-studier i murine LCMV modellen av kronisk virusinfeksjon indikerte at utslitte virus-spesifikke T-celler har redusert cytolytisk funksjon mot virusinfiserte celler, miste sin evne til å spre seg og har redusert evne til å produsere cytokiner slik som IL-2, TNF- α-og IFN-γ 1,2. Et komplekst nettverk av immunoregulatoriske baner, for eksempel PD-1 og IL-10, blir oppregulert ved kroniske infeksjoner og bidrar til T-celle-dysfunksjon (gjennomgått i 3,4). In vivo administrering av blokkerende antistoffer mot disse hemmende baner i LCMV mus Modellen gjen funksjon av utbrukte virus-spesifikke T-celler og forbedret viral klaring, noe som indikerer at T-celleslag er et delvis reversible fenomen (gjennomgått i 5).
Funn på the LCMV modellen ble raskt utvidet til menneskelige kroniske virusinfeksjoner som HBV, HCV og HIV fem. I kronisk HIV-1-infeksjon, er PD-1 og IL-10 banene oppregulert i infiserte individer og korrelerer med parametere av sykdomsprogresjon, direkte med virusmengde og omvendt med CD4-tall 6-8. Antistoff blokade av PD-1 eller IL-10 pathways in vitro gjen spredning av HIV-spesifikke CD4 og CD8 T-celler som indikerer at, i likhet med den LCMV musemodellen, T-celle utmattelse hos mennesker er et delvis reversibelt fenomen. Men på grunn av den skjøre natur av eksperimenter på humane prøver, så vel som begrensninger i følsomheten av in vitro prøver, grundig undersøkelse av de funksjonelle restaurering profilene oppnådd ved disse tiltak er påfallende fraværende. Spredningsanalyser har vært, så langt, den eneste pålitelige in vitro assay testet i de fleste studier, men det er en bemerkelsesverdig mangel på bevis på virkningen av disse interkonvensjoner for: 1) det drepende effekt på cytotoksiske T-celler, 2) den antivirale virkning av T-celler på viral replikasjon, 3) cytokin sekresjon profil, og 4) den virkning på CD4 T-celle-hjelp på andre celleundersett.
Intracellulær cytokin farging (ICS) er et meget nyttig og mye brukt strømningscytometri basert assay som blir brukt til å detektere produksjon av cytokiner i forskjellige celletyper i både mus og mennesker. Det har også blitt brukt til å undersøke effekten av antistoff blokade av inhibitoriske trasé. I ICS analyser, er cytokin sekresjon blokkert ved tilsetning av Brefeldin og / eller Monensin. Cytokiner er fanget inne i cellene blir deretter detektert med fluoriserende antistoffer ved hjelp av polykromatisk strømningscytometri. Varigheten av forsøket, er vanligvis begrenset til 6 eller 12 timer etter antigen-stimulering, siden både Brefeldin og Monensin, som typisk tilsettes i løpet av 2 timer til antigen tillegg er giftige for cellene. ICS-analysen er en kraftfull teknikk som har vært nyttig in undersøkelsen av effekten av in vivo administrering av blokkerende antistoff intervensjon hos mus, hvor celler ble utvunnet etter en viss tid etter at antistoff eksponering 9.. Det er imidlertid flere begrensninger for anvendelse av denne eksperimentelle metode for å evaluere virkningen av blokade av inhibitoriske reseptorer i humane prøver. Ved utførelse av antistoff inngrep av inhibitoriske baner i en 6 eller 12 timers stimulering in vitro (typisk tilfelle med humane prøver), betyr blokade av inhibitoriske reseptorer i de fleste tilfeller ikke endre frekvensen for å reagere antigen-spesifikke T-celler som målt ved standard ICS assays 6, 7. Målinger av per-celle-cytokinproduksjon målt ved midlere eller median fluorescensintensitet har gitt inkonsekvente resultater 6, 7, 10. På den annen side, når ICS er utført på et sent tidspunkt etter stimulering (dvs. seks dager), endringer i antall cytokin-sekresjon calen kan observeres. Forskjellene er en kombinert effekt av endret spredning, overlevelse, og endringer i effektorfunksjon som akkumuleres over spesifisert tidsperiode seks. En måte å delvis overvinne disse begrensningene er å ruge for lengre perioder av gangen (f.eks 36 timers, 60-timers, osv..) Med antigen før tillegg av cytokin sekresjon blocker uten å vente på spredning å skje. Vi har med hell brukt denne metoden til å bestemme kinetikken for cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 og CD8 T-celler 11,12, men det er denne metoden ikke i stand til å detektere små respons og vil ikke gi en integrert resultat av den totale cytokin sekresjon forekommer siden stimulering. Derfor er ikke ICS en følsom nok metode for å påvise virkningen av blokade av hemmende trasé på mengden av cytokiner som produseres av aktiverte T-celler sammenlignet med cytokin mRNA kvantifisering eller målinger av cytokin sekresjon i det overståendet ved de samme tidspunkter. I tillegg er de fleste av cytokiner som produseres av aktiverte T-celler opptrer i autokrin måte ved å bidra til enten positiv eller negativ tilbakekopling sløyfer gjennom interaksjon med antigen-presenterende celler. Derfor er tilsetning av Brefeldin eller Monensin under ICS assay hindrer cytokin-sekresjon og således stimulering av T-celler er ikke optimal. Til slutt, er påvisning av flere cytokiner med ICS begrenset av tilgjengeligheten og sensitiviteten til antistoffer for påvisning av cytokiner med flowcytometri samt av begrensningene i antall fluorokromer som kan anvendes samtidig i en gitt panel.
Vi utviklet en svært følsom in vitro eksperimentell tilnærming for å evaluere virkningen av immunoregulatory trasé i å regulere cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler og deretter CD4 hjelp til antigenpresenterende celler (APC) og naturlige drepeceller (NK-celler). Denne metoden kan også brukes til å evaluere IMPAct av blokade av inhibitoriske molekyler på CD8 T-cellefunksjon ved å tappe CD4 T-celler fra PBMC, eller ved å stimulere med optimale peptider som er anerkjent bare av CD8 T-celler. I motsetning til intracellulære cytokin flekker analyser, bestemte vi oss for ikke å forstyrre den cytokin sekresjon av HIV-spesifikke CD4 T-celler for å kunne: 1) foreta en mer nøyaktig kvantifisering av cytokin nivåer produsert, 2) undersøke et bredere panel av cytokiner eller effektmolekyler, og 3) evaluere effekten av cytokiner produsert av HIV-spesifikke CD4 T-celler på andre celle undergrupper. Vi stimulere CD8 utarmet PBMC med en HIV-1 Gag peptid bassenget i nærvær av blokkerende antistoffer for immunoregulatorisk vei av interesse. Etter den ønskede tiden for inkubasjon, som regel 48 timer, samler vi supernatantene for å måle cytokin sekresjon med perle matriser og samle cellepelletene enten for fenotypisk analyse av de forskjellige celle-undergrupper eller for transkripsjonelle analyser. Av notatet, på thans 48 hr tidspunkt har vi ikke påvise en betydelig bestand av voksende T-celler 12. Dette er en fleksibel tilnærming og flere tilpasninger av denne utforming kan anvendes for å løse forskjellige hypoteser. For eksempel kan de individuelle celleundersett (for eksempel HIV-spesifikke CD4 T-celler eller PD-1 høye CD4 T-celler, etc.) Bli sortert etter 12 timers inkubasjon før ytterligere inkubasjon i 36 timer etterfulgt av samling av supernatanten og cellepelletene å undersøke mer spesifikt virkningen av blokade intervensjoner på cytokin sekresjon av definerte subpopulasjoner av PBMCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Supernatant samlingen er en viktig del av denne eksperimentelle design. Ved høsting av supernatanter for Luminex analyse ble alikvoter tatt opp og holdt ved -80 ° C for å hindre protein nedbrytning på grunn av fryse-tine-sykluser. Frysing og tining kan være tøffe prosesser for proteiner, og ved å minimere fryse-tiner, vil signalet bli maksimert i analyser. Derfor er det lettere å oppnå mer nøyaktige og repeterbare data ved arbeid fra alikvoter som er blitt fryse-tinte det samme antall ganger.
<p class="jov…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gordon Freeman for å gi den anti-PD-L1 blokkerende antistoff. Vi takker klinisk og laboratoriepersonalet ved Massachusetts General Hospital og alle deltagerne for deres uvurderlige rolle i dette prosjektet.
Denne studien ble støttet av National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer av National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), National Heart Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK er støttet av en Forskningsstipendiat Career Award i Quebec Health Research Fund (FRQS). FP er støttet av en stipendet av Massachusetts General Hospital Executive Committee on Forskning og Harvard Global Health Institute (HGHI).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referências
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
- Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
- Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
- Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
- Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
- Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
- Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
- Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
- Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).
