In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função
Summary
Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.
Abstract
T exaustão celular é um fator importante na depuração patógeno falhou durante infecções virais crônicas. Vias imunoreguladores, tais como DP-1 e IL-10, são regulados positivamente em cima desta exposição do antigénio em curso e contribuir para a perda de proliferação, uma redução da função citolítica e auditivos produção de citoquinas por células T CD4 e CD8. No modelo murino de infecção por LCMV, a administração de anticorpos bloqueadores contra estas duas vias aumentou a resposta de células T. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio in vitro para medir o impacto de tal bloqueio na secreção de citocinas em células de amostras humanas. Nosso protocolo ea abordagem experimental nos permitir quantificar de forma precisa e eficiente a restauração da produção de citocinas por células específicas para o HIV CD4 T de indivíduos infectados por VIH.
Aqui, retratam um delineamento experimental in vitro que permite medições de secreção de citocinas por células específicas para o HIV T CD4 e seu impacto no outro cell subconjuntos. Células CD8 T foram esgotadas de sangue total e PBMC restantes foram isolados através do método de separação com Ficoll. As PBMC esgotadas-CD8 foram então incubadas com anticorpos bloqueadores contra a PD-L1 e / ou IL-10Rα e, após a estimulação com um conjunto de peptídeos Gag de HIV-1, as células foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO 2. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para análise de citocinas por contas de matrizes e pellets celulares foram recolhidos para qualquer análise fenotípica por citometria de fluxo ou análise transcricional usando qRT-PCR. Para análise mais pormenorizada, as populações de células diferentes foram obtidos por depleção selectiva subconjunto de PBMC ou por triagem utilizando citometria de fluxo antes de ser avaliado nos mesmos ensaios. Estes métodos proporcionam uma abordagem altamente sensível e específico para determinar a modulação da produção de citoquinas por células T auxiliares específicas para o antigénio e para determinar as interacções funcionais entre as diferentes populações de células imunitárias.
Introduction
Durante infecções virais persistentes, as células-T específicos do vírus adquirir defeitos funcionais em um processo conhecido como T exaustão celular. No início de estudos in vivo no modelo murino de LCMV infecção viral crônica indicaram que as células específicas do vírus exaustos T reduziram função citolítica contra as células infectadas por vírus, perdem a capacidade de proliferar e ter a sua capacidade reduzida para produzir citocinas como IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Uma rede complexa de vias imunoreguladores, tais como DP-1 e IL-10, são regulados positivamente durante infecções crónicas e contribuem para a disfunção de células T (revisto em 3,4). Administração in vivo de anticorpos bloqueadores contra estas vias inibitórias no rato LCMV função das células específicas do vírus exaustos T e depuração viral reforçada modelo restaurado, indicando que células T exaustão é um fenômeno parcialmente reversível (revisto em 5).
Achados no the modelo LCMV foram rapidamente estendido para infecções virais crônicas humanas, tais como HBV, HCV e HIV 5. Na infecção crónica pelo HIV-1, DP-1 e IL-10 são as vias regulada em indivíduos infectados e correlacionam com os parâmetros de progressão da doença, directamente com a carga viral e inversamente com a contagem de CD4 6-8. Anticorpo bloqueio dos PD-1 ou IL-10 in vitro vias restaurada a proliferação de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV, indicando que, tal como o modelo de rato de LCMV, t exaustão de células em seres humanos é um fenómeno é totalmente reversível. No entanto, devido à natureza delicada de experimentos em amostras humanas, bem como limitações na sensibilidade dos ensaios in vitro, investigação completa dos perfis de restauração funcionais obtidos por essas intervenções é notavelmente ausente. Ensaios de proliferação têm sido, até agora, a única no ensaio confiável vitro testado na maioria dos estudos, ainda não há uma notável falta de evidências sobre o impacto dessas interintervenções em: 1) a capacidade de morte de células T citotóxicas, 2) o efeito antiviral de células T na replicação viral, 3) o perfil de secreção de citoquinas, e 4) o efeito sobre a ajuda das células T CD4 + em outros subconjuntos de células.
Citocina coloração intracelular (ICS) é um fluxo muito útil e amplamente utilizado o ensaio baseado citometria que é usado para detectar a produção de citocinas em vários tipos de células em ambos os ratos e os seres humanos. Também tem sido utilizada para investigar o efeito de anticorpos de bloqueio de vias inibitórias. Em ensaios de ICS, a secreção de citocinas é bloqueada pela adição de Brefeldina e / ou monensina. Citocinas presos no interior das células são, então, detectados com anticorpos fluorescentes utilizando citometria de fluxo policromática. A duração do ensaio é normalmente limitada a 6 ou 12 horas após a estimulação de antigénio e uma vez que ambos Brefeldina A monensina, que são tipicamente adicionados a cerca de 2 horas de adição de antigénio, são tóxicos para as células. O ensaio ICS é uma técnica poderosa que tem sido útil in o estudo sobre o efeito da administração in vivo de bloqueio intervenção anticorpo em ratinhos em que as células foram extraídas após um certo período de tempo após a exposição ao anticorpo 9. No entanto, há várias limitações para a aplicação desta abordagem experimental para avaliar o impacto do bloqueamento dos receptores inibitórios em amostras humanas. Ao realizar as intervenções de anticorpos de vias inibitórias em um estimulação de 6 ou 12 horas in vitro (tipicamente o caso com amostras humanas), o bloqueio dos receptores inibitórios na maioria dos casos, não altera a frequência de resposta de células T específicas de antigénio, como medida por ensaios padrão ICS 6, 7. Medidas de produção por célula de citocinas, medidas pela intensidade média ou mediana de fluorescência deram resultados inconsistentes 6, 7, 10. Por outro lado, quando o ICS é realizada a um ponto final de tempo após a estimulação (isto é, seis dias), as alterações no número de secretoras de citocinas cvaras podem ser observados. As diferenças são um efeito combinado da proliferação alterada, a sobrevivência, e alterações na função efetora que se acumulam ao longo do período de tempo especificado 6. Uma maneira de superar parcialmente estas limitações é a incubar durante mais longos períodos de tempo (por exemplo, 36 hr, 60 hr, etc.) Com o antigénio antes da adição do bloqueador de secreção de citoquinas, sem esperar pela proliferação de ocorrer. Nós utilizamos com sucesso este método para determinar a cinética da secreção de citoquinas por células T CD4 e CD8 específicas para o HIV 11,12; no entanto, esta abordagem não é capaz de detectar pequenas respostas e não dará um resultado integrado da secreção total de citocina ocorrendo dado que a estimulação. Portanto, o ICS não é um método sensível para detectar o impacto de bloqueio de vias inibitórias sobre a quantidade de citoquinas produzidas por células T activadas em comparação com citocina quantificação de ARNm ou medições da secreção de citocinas no supernatant no mesmo intervalo de tempo. Além disso, a maioria das citocinas produzidas por células T activadas agir de maneira autócrina ao contribuir para o feedback positivo ou negativo circula através da interacção com as células apresentadoras de antigénios. Portanto, a adição de Brefeldina A monensina ou durante o ensaio ICS impede a secreção de citocinas e, assim, a estimulação de células T não é óptima. Finalmente, a detecção de várias citocinas com o ICS é limitada pela disponibilidade e sensibilidade dos anticorpos para a detecção de citocinas com citometria de fluxo, bem como por limitações no número de fluorocromos que podem ser utilizados em simultâneo, em qualquer dado painel.
Desenvolvemos uma abordagem experimental in vitro, altamente sensível para avaliar o impacto de vias imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV e subsequentemente auxílio de CD4 de células apresentadoras de antígenos (APCs) e células assassinas naturais (células NK). Este método também pode ser utilizado para avaliar o impact do bloqueio de moléculas inibidoras sobre a função das células T CD8 por esgotar as células T CD4 de PBMC ou estimulando com peptídeos ideais que são reconhecidos apenas por células T CD8. Em contraste com os ensaios de coloração de citocinas intracelulares, decidimos não interferir com a secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV, a fim de ser capaz de: 1) realizar uma quantificação mais precisa dos níveis de citocinas produzidos, 2) investigar um painel mais alargado de citocinas ou moléculas efectoras, e 3) avaliar o impacto de citoquinas produzidos por células específicas para o HIV T CD4 em outros subconjuntos de células. Nós estimular CD8 PBMC esgotadas com um HIV-1 Gag conjunto de peptídeos na presença de anticorpos bloqueadores da via imunorregulador de interesse. Após o tempo desejado de incubação, geralmente 48 horas, coletamos os sobrenadantes para medir a secreção de citocinas com matrizes de contas e recolher as pelotas de células, quer para análise fenotípica das diferentes subpopulações de células ou para a análise da transcrição. De nota, em tseu ponto 48 hr tempo, nós não detectar uma população significativa de proliferação de células T 12. Esta é uma abordagem flexível e várias adaptações deste projeto pode ser aplicado para analisar as diferentes hipóteses. Por exemplo, os subconjuntos de células individuais (tais como as células T CD4 + específicas para o HIV ou DP-1 de células T CD4 elevadas, etc.) Podem ser classificados após 12 horas de incubação, antes de nova incubação durante 36 horas seguida por recolha dos sobrenadantes e peletes de células investigar mais especificamente o impacto das intervenções de bloqueio na secreção de citocinas por subpopulações definidas de PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coleção sobrenadante é uma parte fundamental deste projeto experimental. Quando a colher os sobrenadantes para o ensaio de Luminex, as alíquotas foram feitos e mantidos a -80 ° C para evitar a degradação das proteínas devido a ciclos de congelação-descongelação. Congelamento e descongelamento pode ser processos duras para proteínas e minimizando congelar-degelo, o sinal será maximizado em ensaios. Portanto, é mais fácil obter dados repetitivo e mais precisa quando se trabalha a partir de aliquotas que fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Gordon Freeman para fornecer o anticorpo bloqueador anti-PD-L1. Agradecemos ao pessoal clínico e laboratorial no Hospital Geral de Massachusetts e de todos os participantes do estudo para o seu papel inestimável neste projeto.
Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Institutos Nacionais de Saúde (PO1 AI-080192; DEK), o National Heart Lung and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde (RO1 HL-092565; DEK). DEK é apoiado por uma Research Scholar Award Carreira do Fundo de Pesquisa em Saúde Quebec (FRQS). FP é apoiado por uma bolsa comunhão do Massachusetts General Hospital Comitê Executivo de Investigação e do Instituto de Saúde Global de Harvard (HGHI).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
| FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
| LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
Referências
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- Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
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