Vi utvecklade en in vitro-analys för att undersöka vilken roll immun vägar i regleringen av cytokin sekre av HIV-specifika CD4 T-celler.
T-cell utmattning är en viktig faktor i misslyckades patogen clearance vid kroniska virusinfektioner. Immunoreglerande banor, t.ex. PD-1 och IL-10, uppregleras på denna pågående antigenexponering och bidrar till förlust av proliferation, reducerad cytolytisk funktion och försämrad cytokinproduktion av CD4-och CD8-T-celler. I den musmodell av LCMV infektion, administration av blockerande antikroppar mot dessa två vägar augmented T-cellsvar. Det finns dock för närvarande inga in vitro-analys för att mäta effekten av sådan blockad på cytokin sekretion i celler från mänskliga prover. Vår protokoll och experimentell metod ger oss möjlighet att noggrant och effektivt kvantifiera återställande av cytokinproduktion av HIV-specifika CD4 T-celler från HIV-infekterade individer.
Här visar vi ett in vitro-experimentell design som gör mätningar av cytokin sekretion av HIV-specifika CD4 T-celler och deras inverkan på andra cell delmängder. CD8 T-celler utarmat från helblod och återstående PBMC isolerades genom Ficoll separationsmetod. CD8-utarmade PBMC inkuberades därefter med blockerande antikroppar mot PD-L1-och / eller IL-10Rα och, efter stimulering med ett HIV-1 Gag-peptid-poolen, inkuberades celler vid 37 ° C, 5% CO2. Efter 48 timmar, supernatanten uppsamlades för cytokin analys av pärlor arrayer och cellpelletar samlades in för antingen fenotypisk analys med hjälp av flödescytometri eller transkriptionsanalys med användning av QRT-PCR. För mer detaljerad analys, var olika cellpopulationer som erhålls genom selektiv delmängd utarmning från PBMC eller genom att sortera med hjälp av flödescytometri innan de bedömas i samma analyser. Dessa metoder ger en mycket känslig och specifik metod för bestämning av modulering av cytokinproduktion av antigenspecifika T-hjälparceller och för att bestämma funktionella interaktioner mellan olika populationer av immunceller.
Vid ihållande virusinfektioner, virusspecifika-T-celler förvärvar funktionella defekter i en process som kallas T-cell utmattning. Tidigt in vivo-studier på mus LCMV modell av kronisk virusinfektion indikerade att utmattade virusspecifika T-celler har minskat cytolytisk funktion mot virusinfekterade celler, förlorar sin förmåga att föröka sig och har nedsatt förmåga att producera cytokiner såsom IL-2, TNF- α och IFN-γ 1,2. Ett komplext nätverk av immunoreglerande banor, såsom PD-1 och IL-10, uppregleras under kroniska infektioner och bidrar till T-cellsdysfunktion (översikt i 3,4). In vivo-administration av blockerande antikroppar mot dessa hämmande banor i LCMV mus modell återställda funktionen hos utmattade virusspecifika T-celler och förhöjd viral clearance, vilket indikerar att T-cell utmattning är en delvis reversibel fenomen (översikt i 5).
Rön på the LCMV modell var snabbt utvidgas till humana kroniska virusinfektioner, såsom HBV, HCV och HIV 5. Vid kronisk HIV-1-infektion, är PD-1 och IL-10 banor uppregleras i infekterade individer och korrelerar med parametrar för sjukdomsprogression, direkt med virusmängd och omvänt med CD4 räknar 6-8. Antikropp blockad av PD-1 eller IL-10 vägar in vitro återställd proliferation av HIV-specifika CD4-och CD8-T-celler vilket tyder på att, i likhet med LCMV musmodell, är T-cell utmattning hos människa en delvis reversibel fenomen. Men på grund av den känsliga karaktären av experiment på mänskliga prover samt begränsningar i känslighet in vitro-tester, grundlig utredning av de funktionella restaurering profiler som uppnås genom dessa insatser är påfallande frånvarande. Proliferationsanalyser har varit hittills den enda pålitliga in vitro testas i de flesta studier, men det finns en anmärkningsvärd brist på bevis om effekterna av dessa interkonventioner på: 1) dödandet kapaciteten av cytotoxiska T-celler, 2) den antivirala effekten av T-celler på virusreplikation, 3) den cytokinutsöndring profilen, och 4) effekten på CD4 T-cell hjälp på andra cellgrupper.
Intracellulär cytokin-färgning (ICS) är en mycket användbar och mycket använt flödescytometri baserad analys som används för att detektera produktionen av cytokiner i olika celltyper i både möss och människor. Det har också använts för att undersöka effekten av antikroppen blockad av inhibitoriska vägar. I ICS analyser är cytokinutsöndring blockerades genom tillsats av Brefeldin och / eller monensin. Cytokiner fångade inuti cellerna sedan detekteras med fluorescerande antikroppar med hjälp polychromatic flödescytometri. Varaktigheten av analysen är vanligtvis begränsad till 6 eller 12 timmar efter antigenstimulering eftersom både Brefeldin och monensin, som typiskt tillsättes inom 2 h av antigen Dessutom är toxiska för cellerna. ICS-analysen är en kraftfull teknik som har varit till nytta in utredning av effekten av in vivo-administration av blockerande ingrepp antikropp hos möss där cellerna extraherade efter en viss tid efter antikroppsexponering 9. Det finns dock flera begränsningar för tillämpningen av denna experimentella strategi för att utvärdera effekterna av blockaden av hämmande receptorer i humana prover. När du utför antikropps ingripanden av hämmande vägar i en 6 eller 12 h stimulering in vitro (normalt är fallet med humana prover), innebär blockad av hämmande receptorer i de flesta fall inte ändra frekvensen av svarande antigen-specifika T-celler mätt med standard ICS analyser 6, 7. Mätningar av per-cell cytokinproduktion, mätta med medel-eller medianfluorescensintensitet har gett motsägande resultat 6, 7, 10. Å andra sidan, när ICS utförs vid en sen tidpunkt efter stimulering (dvs. sex dagar), förändringar i antalet cytokin-avsöndra calnar kan observeras. Skillnaderna är en kombinerad effekt av förändrad proliferation, överlevnad, och förändringar i effektorfunktion som ackumuleras under den angivna tidsperioden 6. Ett sätt att delvis övervinna dessa begränsningar är att inkubera under längre tid (t.ex. 36 tim, 60 tim, osv.) Med antigenet före tillsatsen av cytokinutsöndring blockerare utan att vänta på proliferation att inträffa. Vi har med framgång använt detta förfarande för att bestämma kinetiken för cytokinutsöndring av HIV-specifika CD4-och CD8-T-celler 11,12, dock är detta tillvägagångssätt inte kan upptäcka små svaren och kommer inte att ge ett integrerat resultat av den totala cytokinutsöndring förekommande eftersom stimulering. Därför är inte ICS en tillräckligt känslig metod för att påvisa effekten av blockaden av hämmande vägar på den mängd cytokiner som produceras av aktiverade T-celler jämfört med cytokin-mRNA kvantifiering eller mätningar av cytokin sekre i supernatant vid samma tidpunkter. Dessutom har de flesta av de cytokiner som produceras av aktiverade T-celler agerar på autokrint sätt genom att bidra till antingen positiva eller negativa återkopplingar genom interaktion med antigenpresenterande celler. Därför är tillsatsen av Brefeldin eller monensin under ICS assay förhindrar cytokinutsöndring och sålunda stimulering av T-celler är inte optimal. Slutligen detektering av flera cytokiner med ICS begränsas av tillgången och känsligheten av antikroppar för detektion av cytokiner med flödescytometri samt genom begränsningar i antalet fluorokromer som kan användas samtidigt i en viss panel.
Vi utvecklade en mycket känslig in vitro experimentell metod för att utvärdera effekterna av immun vägar i reglerande cytokin sekretion av HIV-specifika CD4 T-celler och därefter CD4 hjälp till antigenpresenterande celler (APC) och naturliga mördarceller (NK-celler). Denna metod kan också användas för att utvärdera den impact blockad av hämmande molekyler på cellfunktionen CD8 T genom att tömma de CD4 T-celler från PBMC eller genom att stimulera med optimala peptider som känns igen endast av CD8 T-celler. I motsats till intracellulära cytokin färgning analyser, beslutade vi att inte störa cytokinutsöndring av HIV-specifika CD4 T-celler för att kunna: 1) utföra en mer noggrann kvantifiering av cytokinnivåer produceras, 2) undersöka en bredare panel av cytokiner eller effektormolekyler, och 3) utvärdera effekten av cytokiner som produceras av HIV-specifika CD4 T-celler på andra cellgrupper. Vi stimulera CD8-utarmade PBMC med en HIV-1 Gag-peptid-poolen i närvaro av blockerande antikroppar för immunreglerande reaktionsvägen av intresse. Efter önskad tid för inkubation, oftast 48 timmar, vi samlar supernatanterna att mäta cytokinutsöndring med pärla arrayer och samla cellen pellets antingen för fenotypisk analys av de olika cellgrupper eller för transkriptionsanalys. Av notera, vid thans 48 h tidspunkt, behöver vi inte upptäcka en stor population av prolifererande T-celler 12. Detta är en flexibel hållning och flera anpassningar av denna design kan tillämpas på de olika hypoteser. Till exempel kan de enskilda cellgrupper (till exempel HIV-specifika CD4 T-celler eller PD-1 höga CD4 T-celler, etc.) Sorteras efter 12 timmar av inkubation innan ytterligare inkubation under 36 timmar följt av uppsamling av supernatanterna och cellpellets att undersöka mer specifikt effekterna av blockadåtgärder på cytokin sekretion av definierade subpopulationer av PBMC.
Supernatant samling är en viktigt del av detta experimentella designen. Vid skörd av supernatanterna för Luminex assay alikvoter och förvaras vid -80 ° C för att förhindra proteinnedbrytning på grund av frysning-upptiningscykler. Frysning och upptining kan vara hårda processer för proteiner, och genom att minimera frys-tinar, kommer signalen maximeras i analyser. Därför är det lättare att få repeterbara och noggrannare uppgifter vid arbete från alikvoter som har frys tinade lika många gånger.
<p cl…The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Gordon Freeman för att tillhandahålla anti-PD-L1-blockerande antikropp. Vi tackar den kliniska och laboratoriepersonal vid Massachusetts General Hospital och alla studiedeltagare för deras ovärderliga roll i det här projektet.
Denna studie stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar av National Institutes of Health (PO1 AI-080.192, DEK), National Heart Lung and Blood Institute of National Institutes of Health (RO1 HL-092.565, DEK). DEK stöds av ett Research Scholar karriär Award i Quebec Health Research Fund (FRQS). FP stöds av en gemenskap bidrag på Massachusetts General Hospital verkställande kommitté för forskning och Harvard Global Health Institute (HGHI).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |