O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Summary

Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.

Abstract

Cultura explante permite a manipulação de órgãos em desenvolvimento em pontos de tempo específicos e é, portanto, um método importante para a biologia do desenvolvimento. Para muitos órgãos é de difícil acesso tecido em desenvolvimento para permitir o monitoramento durante ex vivo da cultura. O método de cultura fatia permite o acesso ao tecido para que os movimentos morfogenéticos podem ser seguidas e populações de células específicas podem ser direcionados para a manipulação ou o rastreamento de linhagem.

Neste artigo descrevemos um método de cultura fatia que tem sido muito bem sucedido para a cultura de germes dentários em uma variedade de espécies. O método proporciona um acesso excelente para os germes de dentes, que se desenvolvem a uma taxa semelhante à observada in vivo, rodeado por outros tecidos maxila. Isto permite que as interacções de tecido entre o dente e tecido circundante a ser monitorizado. Embora este documento concentra-se germes de dente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para seguir o desenvolvimento de uma sériede outros órgãos, tais como as glândulas salivares, cartilagem de Meckel, glândulas nasais, língua e orelha.

Introduction

Para um número de experiências é importante ser capaz de cultura de tecidos ex vivo para seguir o desenvolvimento. Cultura de desenvolvimento do tecido proporciona acesso em períodos definidos de desenvolvimento e permite a manipulação de genes através da adição de factores para o meio de cultura, ou em pérolas carregadas, e pela utilização de transfecção e electroporação ^1. Para muitos ensaios, é importante ser capaz de visualizar o tecido à medida que cresce, por exemplo, para seguir o destino de células de linhagem rotulado como o tecido é submetido a morfogénese. Isto pode ser particularmente problemática nos tecidos que se desenvolvem de profundidade dentro do embrião, que não são óbvias, quando um bloco de tecido a partir do embrião é cultivado. Os dentes são bons exemplos disso, como elas se desenvolvem dentro do processo nasal mandíbula, maxilar e frontal. Quando toda a mandíbula é cultivaram as estruturas superficiais do dente podem ser vistos, mas as alterações na morfologia só pode ser analisado depois de seccionamento do tecido fixado <sup> 2. Nós adaptamos uma fatia técnica cultura viva que nos permite acompanhar o desenvolvimento do germe do dente e dar acesso a diferentes partes do dente durante o desenvolvimento. As culturas técnica as fatias germinais dente na interface gás-líquido, usando um método modificado Trowell ^3. Estas culturas fatia têm sido muito úteis em seguir diretamente morfogênese do dente, e permitindo o rastreamento de linhagem de componentes distintos, como o nó do esmalte e da papila dental e do folículo ^1,4-7. A técnica não se limita aos embriões de ratinho e com sucesso tem sido utilizado para cultura de fatias de porco vivos e cobra ^8,9 tecido dental. Para além da vantagem de ser capaz de visualizar o desenvolvimento dos dentes, o método fatia também tem a vantagem de que as fatias finas de tecido ter um maior acesso para os nutrientes a partir do meio e de ar a partir do incubador. Isso resulta em melhor crescimento dos germes dentários, que correspondem desenvolvimento in vivo, e mostram invasião de células endoteliais na papila ^7. Em contraste, os germes de dentes em culturas de mandíbula inteiros desenvolver mais lento do que os in vivo, e o centro da cultura é frequentemente necrosado em culturas de longo prazo. Na cultura fatia, o dente desenvolve dentro de uma fatia de mandíbula, e a sua interacção com o desenvolvimento de osso circundante e outros tecidos podem ser monitorizados. Em nosso método, o tecido é cortado logo após dissecção sem a necessidade de incorporar em um meio de suporte ^10,11 e não há necessidade de qualquer sistema para prender o tecido para o bloco de desbastamento. O método é, por conseguinte, não invasiva e rápida, permitindo que muitas mandíbulas para ser seccionado em uma sessão.

Protocol

1. Estabelecer Afiar instrumentos de dissecção (utilizando uma pedra de afiar lubrificado com óleo mineral) e esterilizar antes da sua utilização para a cultura de órgãos, utilizando um pulverizador de etanol a 70% e a esterilização por calor seco. Afie as agulhas de dissecação através da eletrólise em hidróxido de sódio 2 M usando uma alimentação de 12 V. Preparar o meio de cultura utilizado para a dissecção e a cultura de órgãos embrionários, que consiste de Meio de Eagle Mod…

Representative Results

De modo a seguir o movimento do primeiro folículo molar, 250 mM fatias frontais foram tomadas através de uma mandíbula, utilizando o método descrito acima. O folículo é a camada de mesênquima que rodeia o esmalte epitélio exterior (OEE) do dente em desenvolvimento, e tem sido mostrado previamente para participar na formação de tecido do periodonto 6. Mandíbulas foram dissecadas na E14.5, o estágio tampa do desenvolvimento dentário. No corte do contorno do epitélio dental foi claro, e o mesênqui…

Discussion

Este método de cultura de dentes tem a vantagem de que o acesso ao germe do dente é excelente, permitindo linhagem precisas rastreio e colocação de grânulos no interior do epitélio ou mesênquima. Regiões definidas do germe do dente em desenvolvimento pode, por conseguinte, ser dirigida especificamente. Durante a cultura a morfologia mudança do germe do dente podem ser seguidos, e o efeito de manipulações rapidamente avaliada.

O método, no entanto, é apenas apropriado para germes…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	101077Y	100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
	Invitrogen
Penicillin-streptomycin	Sigma	P0781
DiI (Molecular probes)	Vybrant	V-22885	Cell-labeling solution
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO (Molecular probes)	Vybrant	V22886
	Invitrogen
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Dry-heat sterilization
McIlwain tissue chopper	Ted Pella, Inc.	10180	Standard table
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish)	Falcon	353037
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size)	BD Falcon	353090	PET track-etched membrane, 6-well format
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh)	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Single channel picospritzer III
Glass capillary with filament 1 mm	WPI	TW100F-4
Tungsten wire 0.1 mm	Goodfellow	W005138
Tungsten wire 0.38 mm	Goodfellow	W005155
Aspirator tubes	Sigma	A5177	Used for mouth aspiration lineage tracers