La méthode la Culture Slice pour la suite du développement des germes de dents dans explantation Culture
Summary
Ici, nous détaillons une méthode de culture des germes de dents dans la mandibule tranches en utilisant un broyeur de tissus. Cette méthode permet un accès unique à la dent au cours du développement, offrant une excellente occasion pour la manipulation et de la lignée de traçage, pas disponible en utilisant des méthodes de culture traditionnelles.
Abstract
culture de l'explantation permet la manipulation de développer des organes à des moments spécifiques et est donc un moyen important pour la biologie du développement. Pour de nombreux organes, il est difficile d'accéder à un tissu en développement pour permettre la surveillance au cours de la culture ex vivo. Procédé de culture de tranche permet l'accès à un tissu de sorte que les mouvements morphogénétiques peuvent être suivies et des populations de cellules spécifiques peuvent être ciblés pour la manipulation ou la lignée de traçage.
Dans cet article, nous décrivons une méthode de culture de la tranche qui a été très fructueuse pour la culture des germes de dents dans une gamme d'espèces. La méthode offre un excellent accès aux germes dentaires, qui se développent à un rythme similaire à celui observé in vivo, entouré par les autres tissus de la mâchoire. Ceci permet des interactions entre tissus situés entre la dent et du tissu environnant à contrôler. Bien que ce document se concentre sur les germes dentaires, le même protocole peut être appliqué à suivre le développement d'un certain nombred'autres organes, comme les glandes salivaires, le cartilage de Meckel, les glandes nasales, de la langue, et l'oreille.
Introduction
Pour un certain nombre d'expériences, il est important d'être en mesure de tissu de culture ex vivo pour suivre le développement. Culture de développer le tissu permet d'accéder à des périodes déterminées de développement et permet la manipulation de gènes par l'addition de facteurs de milieu de culture, ou sur des billes chargées, et par l'utilisation de la transfection et électroporation 1. Pour de nombreuses expériences, il est important d'être capable de visualiser le tissu pendant sa croissance, par exemple, de suivre le sort des cellules de la lignée marqué que le tissu est soumis à la morphogenèse. Cela peut être particulièrement problématique pour les tissus qui se développent plus profond de l'embryon, qui ne sont pas évidentes lorsque un bloc de tissu à partir de l'embryon est mis en culture. Les dents sont de bons exemples de ce qui se développent au sein du processus nasal mandibule, maxillaire et frontal. Lorsque l'ensemble de la mandibule est cultivé les structures superficielles de la dent peut être consulté mais des changements dans la morphologie ne peuvent être analysés après la coupe de tissu fixe <sjusqu'à> 2. Nous avons adapté une technique de culture de tranche en direct nous permettant de suivre le développement du germe dentaire et l'accès aux différentes parties de la dent au cours du développement. Les cultures de la technique des tranches dent germinales à l'interface gaz-liquide, en utilisant une méthode Trowell modifiée 3. Ces cultures tranche ont été très utiles en suivant directement la morphogenèse de la dent, et en permettant le traçage lignée de composants distincts, tels que le noeud de l'émail et de la papille dentaire et follicule 1,4-7. La technique ne se limite pas à des embryons de souris et a été utilisé avec succès pour la culture tranches en direct de porc et serpent dentaire 8,9 tissulaire. En plus de l'avantage d'être en mesure de visualiser le développement des dents, la méthode de la tranche a aussi l'avantage que les fines tranches de tissu ont un accès accru à des éléments nutritifs du milieu et de l'air de l'incubateur. Il en résulte une amélioration de la croissance des germes dentaires, qui correspondent le développement in vivo, et montrent invasion des cellules endothéliales dans la papille 7. En revanche, les germes dentaires dans des cultures entières mandibule se développent plus lentement que ceux in vivo et le centre de la culture est souvent nécrotique dans des cultures à long terme. Dans la culture de la tranche, la dent se développe à l'intérieur d'une tranche de la mâchoire, et son interaction avec le développement de l'os environnant et d'autres tissus peut être surveillée. Dans notre procédé, le tissu est coupé immédiatement après dissection sans qu'il soit nécessaire d'incorporer dans un milieu de support 10,11 et aucun besoin pour un système pour fixer le tissu sur le billot. La méthode est donc non invasive et rapide, permettant à de nombreux mandibules à sectionnés en une seule session.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode de culture de la dent présente l'avantage que l'accès au germe de la dent est excellente, ce qui permet lignée de traçage précis et le placement des billes à l'intérieur de l'épithélium ou du mésenchyme. Régions définies du germe dentaire en développement peuvent donc être spécifiquement ciblées. Au cours de la culture de la morphologie évolution du germe de la dent peut être suivie, et l'effet de manipulations a rapidement évalué.
Le pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sarah A. Alfaqeeh est financé par Genre Saud University College of Dentistry, Ministère de l'Enseignement Supérieur, Royaume d'Arabie Saoudite.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H2O to 70%. |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| Invitrogen | |||
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
| Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
| DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
| Invitrogen | |||
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
| McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
| Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
| Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
| Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow Direct Heat CO2 Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
| Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |
Referências
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