Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi
Summary
Hızlı antibiyotik duyarlılık testi için mikroakışkan bir platform geliştirdik. Sıvı, mikroakışkan bir kanalın dibinde hareketsiz hale getirilen bakteriler üzerinde yüksek hızlarda geçirilir. Stres ve antibiyotik varlığında, hassas bakteri suşları hızla ölür. Ancak dirençli bakteriler bu stresli koşullarda hayatta kalabilirler.
Abstract
Strese dayalı bir ortamda antibiyotik duyarlılığı testi için hızlı bir mikroakışkan yöntem geliştirdik. Sıvı, mikroakışkan bir kanalın dibinde hareketsiz hale getirilen bakteriler üzerinde yüksek hızlarda geçirilir. Stres ve antibiyotik varlığında, hassas bakteri suşları hızla ölür. Ancak dirençli bakteriler bu stresli koşullarda hayatta kalabiliyor. Bu yöntemin arkasındaki hipotez yenidir: antibiyotiklerin hedefi olan biyokimyasal yolların stres aktivasyonu antibiyotik duyarlılık testini hızlandırabilir. Standart antibiyotik duyarlılık test yöntemleri ile karşılaştırıldığında, antibiyotik uygulaması sırasında hız sınırlayıcı adım – bakteriyel büyüme – atlanır. Yöntemin teknik uygulaması standart teknikler ve yenilikçi yaklaşımların bir kombinasyonundadır. Yöntemin standart bölümleri arasında bakteri kültürü protokolleri, polidimetilsiloksan (PDMS) içinde mikroakışkan kanalların tanımlanması, floresan ile hücre canlılığı izleme ve bakteri sayımı için toplu görüntü işleme yer almaktadır. Yöntemin yenilikçi kısımları, mekanik stres uygulaması için kültür ortam akışının kullanılması, bakterilere zarar vermek ancak öldürmemek için enzimlerin kullanılması ve bakteri bağlanması için mikroarray substratlarının kullanılmasıdır. Geliştirilen platform antibiyotik ve nonantizyotik ile ilgili ilaç geliştirme ve testlerinde kullanılabilir. Standart bakteriyel süspansiyon deneylerine kıyasla, ilacın etkisi kontrollü zaman periyotlarında tekrar tekrar açılıp kapatılabilir. Aynı bakteri popülasyonunun tekrarlayan gözlemi aynı deney boyunca mümkündür.
Introduction
Bakteri direncinin artması, son çare ilaçlarımızı korumak için hızlı fenotip bazlı antibiyotik duyarlılık testlerine olan ihtiyacı yoğunlaştırmaktadır. Standart duyarlılık testleri, tamamlanması birden fazla (8-24) saat süren antibiyotiklerin varlığında bakteri üreme inhibisyonunu temel alır. Antibiyotiklerin eylemini hızlandırmak için biyosintetik yolların stres aktivasyonuna dayanan mikroakışkan bir platformda yeni bir antibiyotik duyarlılık testi geliştirdik.
Mikroakışkan ölçekte antibiyotik duyarlılık testleri, az sayıda bakteri gerektirdiğinden etkili numune kullanımının avantajını taşır. Ayrıca, mikroakışkan cihazlar birden fazla örnek birden fazla koşulda test etmek için çoklayıcı olabilir1,2. Son zamanlarda, antibiyotik duyarlılık testi için bir dizi mikroakışkan yöntem bildirilmiştir3-9. Bu yöntemlerde, bakteriler nano ve picoliter damlacıkları içinde yetiştirilir3,7Mikroakışkan kanalın tam hacminde4-6,8veya tek bakteri olarak kanalın alt yüzeyine elektriksel olarak lokalize9. Bu testler mikroakışkan kanallarda yapılmasına rağmen, hepsi geleneksel yöntemlere benzer antibiyotiklerin varlığı ve yokluğunda mikrobiyal büyümeyi izler. Büyüme ölçümleri optik yoğunluk, pH’a duyarlı boyalar veya parlak alan/faz kontrastı veya floresan görüntüler aracılığıyla alınır. Bu testlerin bazıları geleneksel yöntemlerden daha hızlı olsa da, her biri pasif olarak antibiyotik direncini tespit ederler. Başka bir deyişle, bu yöntemler hala kullanıcının son okuma olarak bakteri üremesini beklemesini gerektirir.
Buna karşılık, antibiyotiğe duyarlı biyokimyasal yolları etkinleştirmek için kesme ve enzimatik stresin bir kombinasyonunu kullanan bir yöntem geliştirdik10. Stresli bakterilere bu antibiyotiklerle meydan okumak daha hızlı bir duyarlılık testi oluşturur. Antibiyotiğe dirençli bakteriler stresli koşullara dayanabilir. Öte yandan, hassas bakteriler, kombine stresler tarafından hızla öldürülür. Floresan ölü hücre lekesi kullanılarak mikroskopi ile ölçülen bir saat sonra hücre ölüm yüzdesi, bakterilerin fenotipini tanımlar (dirençli vs. duyarlı).
Yöntemimizin başarılı bir şekilde uygulanması için bakterilerin mikroakışkan kanalın alt yüzeyinde hareketsiz hale getirilmelidir. Bu şekilde bakteriler çeşitli streslere maruz kalabiliyor ve aynı anda tek bir düzlemde mikroskop altında görüntülenebiliyor. Bakterilerin hareketsiz hale getirilmesi için kaplamalı mikroskop cam kaydırak kullanılır. Slayt, üretici tarafından spesifik olmayan protein bağlama için epoksit grupları ile önceden kaplanmıştır. Bu epoksitlerin bakteriyel yüzey proteinlerine spesifik olmayan bağlanması, bakterileri slayt yüzeyine katarak kovalentli olarak bağlar.
Suşlar, antibiyotik yokluğunda (kontrol) ve mevcudiyetinde (deney) aynı koşullar altında (kesme + enzimatik stres) test edilir. Her kanalın faz kontrastı ve floresan mikroskop resimleri bir saat boyunca her iki dakikada bir otomatik olarak alınır. Daha sonra deney kanalındaki ölü bakterilerin yüzdesi kontrol kanalında bulunanlarla karşılaştırılarak direnç tanımlamaları yapılır. Bir saat sonra, hücre ölüm yüzdesi% 1’den büyük olan bir örnek duyarlı olarak kabul edilirken,% 0.5’ten az ölüm direncin göstergesidir. Bu iki kesme arasına giren yüzdeler belirsiz olarak kabul edilir ve örnek tekrar test edilmelidir.
Mikroakışkan kanallar, mikroakışkan cihazlar için tercih edilen bir malzeme olan PDMS’de tanımlanır11. PDMS, biyouyumlu, atıl, gazlara geçirgen ve sıvılara geçirgenliği düşük, çok çeşitli dalga boylarında optik olarak şeffaftır; bu nedenle bu deneyler için çok uygundur.
Mekanik/kesme stresi, oda sıcaklığı ortamlarının hareketsiz bakteriler üzerinden akmasıyla oluşur. (Not: Ortamın 37 °C’ye kadar ısınmasının test sonucu üzerinde önemli bir etkisi yoktur.) Otomatik şırınga pompaları, 6,25 kPa kesme kuvveti veya 6.000 sn-1kesme hızı vermek için 1 ml/dk akış hızında mikroakışkan kanallardan (200 μm x 400 μm) medyayı (ölü hücre lekesi +/- antibiyotik ve isteğe bağlı enzymatic stressörler içerir) zorlar. Bu oran, Staphylococciüzerinde daha önce çalışılan kesme gerilmelerine eşittir veya aşar.
Lysostaphin enzimi, Staphylococcus hücre duvarına doğrudan zarar verdiği için ön deneyler için seçildi. Lisostafin konsantrasyonu (0.7 ng/ml) bakteri hücre duvarı hasarına neden olmak için yeterliydi, ancak deneyin zaman diliminde antibiyotik olmadan bakteri hücresi ölümüne neden olmak için yeterli değildi. Lysostaphin bakteriyel duyarlılığın doğru tanımlanması için gerekli değildir, ancak sonucu artırarak hassas suşlarda hücre ölümünün artmasına yol açar. Buna karşılık, kesme stresi tahlil fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Metisiline duyarlı Staphylococcus aureus suşları akış yokluğunda lysostaphin ve oksasilin ile tedavi edildiğinde, deney boyunca hücre ölümü kaydedilmemektedir.
Hücre canlılığı floresan ölü hücre lekesi ile izlenir12. Boyanın seçimi, sadece hasarlı hücreleri seçici olarak lekeleme yeteneğine, canlı hücrelere olan sarhoşluğuna ve ek adımlar olmadan hücre ortamına doğrudan eklenmesine izin veren düşük arka plan floresansına dayanıyordu. 0.25 μM floresan boya konsantrasyonunun seçimi, floresan ekscitasyon ışığına 1.6 sn maruz kalma süresi boyunca kabul edilebilir sinyal seviyeleri elde etmekti.
Ön çalışmalarımızda beta-laktam, oksasilin kullanıldı. Metisiline dirençli S. aureus (MRSA) türleri oksilasiline karşı dirençlidir ve deneyin zaman diliminde kayda değer bir hücre ölümü göstermez. Ön çalışmalarda 50 μg/ml konsantrasyon belirlendi. Daha düşük antibiyotik konsantrasyonları dirençli ve hassas suşlar arasında daha az ayrım yaparken, daha yüksek konsantrasyonlar deneysel sonuçlarda kayda değer bir farka neden olmadı.
Daha önce bakteriyel hücre duvarı13’ü doğrudan etkileyen mekanik ve enzimatik stresleri hücre duvarı biyosentezini inhibe eden bir antibiyotikle birleştiren bir testin başarılı gelişimini bildirdik14,15. Bu ilke kanıtı deneyleri MRSA ve metisiline duyarlı S. aureus (MSSA) panelinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, uygun deneysel parametrelerin seçimi ile yöntemimiz birden fazla bakteri türüne ve birden fazla antibiyotik sınıfına uygulanmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, metisiline duyarlı ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus suşları10ile yapılan bir dizi deneyde doğrulandı ve optimize edildi. Bu nedenle, bu protokol değiştirilmeden, bakteri hücre duvarı biyosentezini etkileyen etki mekanizmalarına sahip diğer S. aureus suşları ve diğer antibiyotikler için doğrudan uygulanmalıdır. S. aureus dışındaki bakteri türleri stres parametrelerinde değişiklik gerektirebilir: çözünür (enzymatic) ve mekanik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fraunhofer Üretim İnovasyon Merkezi’ndeki mühendislere ve öğrencilere teşekkür ediyoruz. Deneysel sistemin tasarımına, işlenmesine ve otomasyonuna yardımcı olduğu için Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin ve Dr. Sudong Shu’ya teşekkür ederiz. Deneysel protokollerin test ve veri toplama konusundaki yardımları için Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu ve Katarzyna Kuliga’ya teşekkür ederiz. CellProfiler’deki görüntü analizi rutininin geliştirilmesine yardımcı olmak için Harvard ve MIT Geniş Enstitüsü Görüntüleme Platformu’ndan Dr. Anne E. Carpenter ve Mark-Anthony Bray’i kabul ediyoruz. Açıklanan proje kısmen Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü’nden R21AI079474 ve 1R01AI101446 Ödülleri tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü’nün veya Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Proje Fraunhofer USA tarafından da desteklendi.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
Referências
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
