Redning av rekombinant Newcastle Disease Virus fra cDNA

Summary

Newcastle disease virus (NDV) har blitt grundig studert i de siste årene for å utvikle nye vektorer for vaksinering og behandling, blant andre. Disse studiene har vært mulig på grunn av teknikker for å redde rekombinant virus fra cDNA, for eksempel de som beskrives her.

Abstract

Newcastle sykdomsvirus (NDV), prototypen medlem av slekten Avulavirus av familien Paramyxoviridae ^1, er en ikke-segmentert negativ-sense, enkjedet, innhyllet RNA-virus (figur 1) med potensielle anvendelser som en vektor for vaksinasjon og behandling av menneskelige sykdommer. I inngående utforskning av disse programmene har bare blitt mulig etter etableringen av revers genetikk teknikker for å redde rekombinante virus fra plasmider som koder sine komplette genomer som cDNA ^2-5. Viral cDNA kan enkelt modifiseres in vitro ved hjelp av standard-kloningsfremgangsmåter for å endre genotypen av viruset og / eller å inkludere nye transkripsjonelle enheter. Redning av slike genetisk modifiserte virus gir et verdifullt verktøy for å forstå faktorer som påvirker flere stadier av infeksjonen, samt gir mulighet for utvikling og forbedring av vektorer for ekspresjon og levering av antigenerfor vaksinering og behandling. Her beskriver vi en protokoll for redning av rekombinante NDVs.

Introduction

Newcastle disease virus (NDV), en aviær paramyxovirus tilhører Avulavirus slekten ^1, er en økonomisk relevant og dermed mye forsket på og overvåket zoonotiske agent, som kan alvorlig påvirke fjørfe landbruk over hele verden. Selv ikke en menneskelig patogen, NDV har også blitt grundig studert utover veterinær feltet både som modell paramyxovirus og på grunn av sin svært interessante natur onkolytiske egenskaper ^seks. Forskning på NDV stor nytte av utviklingen av revers genetikk teknikker for single-strandet, ikke-segmenterte negative-sense RNA virus, først beskrevet for rabies virus ved Conzelmann og coleagues ^to. En rekke av genmodifiserte NDVs, bærer utenlandske gener eller modifikasjoner av deres villtype genom har vært mye studert siden den gang. Arbeidet med disse rekombinante virus har vært kritisk til å karakterisere ulike virulensfaktorer ikke bare av NDV men også av annen relevant Human patogener som influensa A virus ⁷ – eller den emergent Nipah viruset ^åtte. Videre har en rekke forskjellige undersøkelser utforsket anvendelsen av disse teknikker for å forbedre den iboende antitumoraktivitet av NDV ^6,9,10, for det meste ved å styrke de immunstimulerende egenskaper av viruset. Annen relevant område for forskning på rekombinante NDVs har vært dannelsen av vaksinekandidater mot andre virale sykdommer som influensa ^5,11,12, HIV ^13, meslinger ^14, SARS ^15, eller som er forårsaket av luft sincytial virus (RSV) ^16. Blant de ulike bemerkelsesverdige fordeler som tilbys av NDV er mangelen på preexisting immunitet i menneskelige populasjoner, stabiliteten av de utenlandske genetiske inserts, en mangel på recombinatory aktivitet og samlet en høy sikkerhetsprofil kombinert med de nevnte naturlige immunstimulerende egenskaper ^17. Det er også verdt å merke seg den potensielle bruken av rekombinante toverdige vaksiner i poultry, virus beskyttende mot både NDV og høypatogen aviær influensa ^11,12. Dette kan være en utmerket måte å redusere sjansene for sistnevnte sprer seg fra vill til husdyr, og dermed også bidra til å forhindre en mulig inter-spesifikk hoppe av den fryktede fugleinfluensa hos mennesker. Endelig reporter-uttrykk NDV har blitt benyttet for evaluering av medfødte immunresponser, samt identifikasjon av interferon antagonist kodet av flere virus ^18-27.

Rednings prosess med et rekombinant, ikke-segmentert, består negativ-trådet RNA-virus i utgangspunktet på kunstig måte å tvinge et viralt replikasjonssyklus i en produserende celler ved transfeksjon av cDNA som koder for den minimale infeksiøs molekyl maskiner, kjent som ribonucleoprotein eller RNP (figur 2). De RNPs består av viral polymerase (P-og L-proteiner), til nukleoprotein (NP) og full-lengde RNA antigenomic av viruset. Dette RNA + antigenome er the mal nødvendig for genereringen av de komplementære RNA-genom, noe som også er forbundet med de andre proteiner av virus RNP, sammenfatter det samme infeksiøse kompleks som en naturlig virus vil frigjøre til cytoplasma av cellen ved infeksjon (figur 2A ). Fra dette trinnet og utover, kan den virale syklusen fortsette naturlig og rekombinant virioner, encapsidating de modifiserte genomer, vil bli generert (figur 2B). Bemerkelsesverdig, transfeksjon av det genomiske cDNA i stedet for det antigenomic cDNA i stor grad svekker eller helt opphever rednings effektivitet ^2,28-30. Selv når antigenomic cDNA blir transfektert, er effektiviteten av den encapsidation av det rekombinante RNA til RNPs i transfekterte celler sannsynligvis svært lav. På grunn av dette, rednings-protokoller for NDV ofte inneholde forskjellige trinn for forsterkning av de få virus-partikler som frigjøres fra de opprinnelig transfekterte celler ved coculturing dem med ettergivende celler og / eller avinfeksjon av embryonated egg.

Forut for redning, kan cDNA bli manipulert ved hjelp av standard kloningsprosedyrer for å generere de ønskede modifikasjoner. Mens spesifikke mutasjoner av de forskjellige genprodukter og regulatoriske sekvenser av viruset kan være oversiktlig oppnås på denne måten, har mange av de publiserte arbeid med rekombinant NDV nødvendig tillegg av en ny transkripsjonsenhet inn i NDV genom. I likhet med andre medlemmer av familien paramyxovirus, koder for NDV-genomet åtte forskjellige proteiner i seks transkripsjonelle enheter, som er differensielt uttrykt avhengig av deres plassering i forhold til 3'-enden i en avtagende gradient kritisk for viral livssyklus ^1.. På grunn av dette, må plasseringen av nye transkripsjons-enhet i genomet velges med omhu for å oppnå en balanse mellom ekspresjonen av transgenet og nedskrivning av viral replikasjon. Innsetting mellom P og M gener har blitt brukt for de fleste, tHough andre nettsteder har også blitt testet ^13,31.

Når innsatsen, kloning inn i NDV cDNA behov for å følge noen regler for å generere en rescuable konstruksjon: (i) eventuelle nye genet som skal inkluderes i det NDV-genomet har til å være under kontroll av de hensiktsmessige signaler til det virale RNA-avhengig-RNA polymerase. Disse sekvensene må tilsettes oppstrøms for det nye åpne leseramme (ORF), slik at polymerase kan gjenkjenne slutten av forrige genet (GE) og begynnelsen av den nye transgenet (GS), adskilt av et enkelt nukleotid intergenic sekvens (IG) . Tilsetning av en gyldig Kozak (K) sekvens for å forbedre eukaryot ribosomal oversettelsen er også anbefalt for bedre fremmed protein ekspresjon ^32, (ii) effektiv replikasjonen av NDV, som for de fleste medlemmer av familien Paramyxoviridae, er avhengig av genomet lengden være multiplum av seks ^33, og derfor har noen innsetting i NDV å følge denne "regelen av seks". Hvis det er nødvendig, required ytterligere nukleotider kan bli lagt til den nye nedstrøms ORF, og (iii) en sekvens av transgenet bør kontrolleres for å finne mulige GE-og GS-lignende sekvenser som kunne nedsette rednings effektivitet, transgene ekspresjon og / eller virus levedyktighet. Hvis til stede, må disse sekvenser kan fjernes ved stille mutagenese. Den generasjonen av rekombinant full lengde cDNA etter nevnte regler er det første skrittet for å effektivt produsere en genmodifisert NDV som beskrevet her.

I det system som alle DNA-konstruksjoner er under kontroll av T7 RNA polymerase promoter (figur 3). Det cytoplasmatiske polymerase er gitt i trans ved coinfection med en rekombinant modifisert vaccinia-virus Ankara (MVA-T7) ^34. Figur 3A viser pNDV-B1-plasmidet, som koder for full-lengde cDNA antigenomic ^5. Figur 3B viser pTM1 plasmider som koder for NP, P-og L-ORF'er. Plasmider pCITE-GFP, som koder, under til T7-promoteren, Green Fluorescent Protein (GFP) og pCAGGs GFP ^18, som koder for den samme ORF under kylling beta-aktin promoter som ^35, blir brukt som kontroller. I denne protokollen viser vi prosedyren for å redde rekombinant NDV fra cDNA av lentogenic NDV belastningen Hitchner B1 ⁵ (figur 4).

Protocol

En. Fremstilling av pattedyrceller (figur 4A, dag 1) Split HEp-2 eller A549 celler dagen før transfeksjon i 6-brønn plater. Tetthet av cellene skal nå 80-90% samløpet neste dag. Vanligvis kan en konfluent 100 mm fatet bli delt inn i åtte brønner (rundt 1 x 10 6 celler per brønn). For hver virus å bli reddet, bør 2-4 forskjellige brønner inkluderes, samt to ekstra brønner for kontrollene pCAGGs-GFP og pCITE-GFP 18, tok sikte på å overvåke tra…

Representative Results

Redningen av NDV er en godt etablert prosedyre, rutinemessig utført i laboratoriene som har tilgang til den komplette cDNA av viruset. Imidlertid gjør den iboende stokastiske karakter av metoden er det vanskelig å oppnå 100% rednings effektivitet. Overvåking av de tidlige trinn av prosessen, spesielt transfeksjon effektivitet og infeksjon med MVA-T7, bidrar til å identifisere mulige problemer. Figur 5A viser standard transfeksjon og transfeksjon / infeksjonseffektivitet som er tilstrekkelig for en…

Discussion

Flere faktorer som skal vurderes for å oppnå gode resultater, mens redde NDV. For det første må den full-lengde cDNA-konstruksjon som skal benyttes til å være utformet for å tillate den funksjonelle inkorporering av de nye transgener / modifikasjoner i det NDV-genomet. Dette betyr, som nevnt ovenfor, at (i) passende genet end (GE), intergenic (IG) og genet start (GS) sekvenser er å bli lagt om nødvendig, (ii) det er ingen antatte GE eller GS sekvenser inn i utenlandske gen, og (iii) den fullstendige rekombinant…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.