Räddning av rekombinant Newcastlevirus från cDNA

Summary

Newcastlevirus (NDV) har studerats under de senaste åren för att utveckla nya vektorer för vaccinering och behandling, bland annat. Dessa studier har varit möjlig på grund av tekniker för att rädda rekombinant virus från cDNA, såsom de som vi beskriver här.

Abstract

Newcastlesjukevirus (NDV), prototypen medlem av Avulavirus släkte av familjen Paramyxoviridae ^1, är en icke-segmenterade, negativ-sense, single-stranded, omsluten RNA-virus (fig 1) med potentiella tillämpningar som en vektor för vaccination och behandling av mänskliga sjukdomar. Fördjupad undersökning av dessa ansökningar har bara blivit möjlig efter införandet av omvänd genetik att rädda rekombinanta virus från plasmider som kodar för sina kompletta genom som cDNA ^2-5. Viral cDNA kan enkelt modifieras in vitro genom användning av standardklonings-förfaranden för att ändra genotypen av viruset och / eller att inkludera nya transkriptionsenheter. Räddning av sådana genetiskt modifierade virus utgör ett värdefullt verktyg för att förstå faktorer som påverkar multipla stadier av infektion, såväl som möjliggör utveckling och förbättring av vektorer för expression och tillförsel av antigenerför vaccinering och behandling. Här beskriver vi ett protokoll för att rädda rekombinanta NDVs.

Introduction

Newcastlevirus (NDV), en avian paramyxovirus tillhör Avulavirus släktet ^1, är en ekonomiskt relevant och därmed allmänt forskat och övervakade zoonotiska smittämnet, som allvarligt kan påverka fjäderfäuppfödning runt om i världen. Även om inte en mänsklig patogen, NDV har också studerats ingående utanför veterinär området både som modell paramyxovirus och på grund av sin mycket intressanta, naturliga oncolytic egenskaper ^6. Forskning om NDV stor nytta av utvecklingen av omvänd genetik för enkelsträngade, icke-segmenterade negativ-sense RNA-virus, först beskrivna för rabiesvirus från Conzelmann och coleagues ^2. En mängd genetiskt modifierade NDVs, bär främmande gener eller modifieringar av deras vildtyp genomet har studerats sedan dess. Arbetet med dessa rekombinanta virus har varit avgörande för att karakterisera olika virulensfaktorer inte bara av NDV utan också av andra relevanta human patogener som influensa A-virus ⁷ – eller den framväxande nipahvirus ^8. Dessutom har ett antal olika studier undersökte användningen av dessa tekniker för att förbättra den inneboende antitumöraktivitet av NDV ^6,9,10, främst genom att öka den immunstimulerande egenskaper av viruset. Annan relevant område av forskning på rekombinanta NDVs har varit alstringen av vaccinkandidater mot andra virala sjukdomar såsom influensa ^5,11,12, HIV ¹³ mässlings ^14, SARS ^15, eller den som orsakas av det respiratoriska sincytial virus (RSV) ^16. Bland de olika anmärkningsvärda fördelar som NDV är bristen på redan existerande immunitet i befolkningsgrupper, stabiliteten i de utländska genetiska insatser, brist på recombinatory aktivitet och övergripande en hög säkerhetsprofil i kombination med de ovan nämnda naturliga immunstimulerande egenskaper ^17. Det är också anmärkningsvärt att potentiella användningen av rekombinanta bivalenta vacciner i poultry, virus skydd mot både NDV och högpatogen aviär influensa ^11,12. Detta kan vara ett utmärkt sätt att minska risken för de senare sprids från vilda till tama djur, vilket också bidrar till att förhindra en eventuell interspecifik hoppa av den fruktade fågelinfluensan för människor. Slutligen reporter uttrycker NDV har använts för utvärdering av medfödda immunsvar samt identifiering av interferon antagonist kodas av flera virus ^18-27.

Räddningsprocessen av en rekombinant, icke-segmenterade, negativ-strängat RNA-virus består i princip på ett konstlat sätt tvingar en viral replikationscykeln i en producerande cell genom att transfektera cDNA som kodar för den minimala infektiösa molekylära maskineri, som kallas ribonukleoprotein eller RNP (Figur 2). De RNPs bestå av det virala polymeraset (P-och L-proteiner), varvid nukleoprotein (NP) och fullängds-antigenomiskt RNA av viruset. Denna RNA + antigenom är the-mall som krävs för att generera de komplementära RNA-genom, som, även i samband med resten av proteinerna i den virala RNP, rekapitulerar samma smitt komplex som en naturlig virus skulle släppa på cellens cytoplasma vid infektion (Figur 2A ). Från detta steg framåt, kan den virala cykeln vidare naturligt och rekombinanta virioner encapsidating de modifierade genomen, kommer att genereras (Figur 2B). Anmärkningsvärt, transfektion av den genomiska cDNA istället för den antigenomiska cDNA försämrar kraftigt eller upphäver räddnings effektivitet ^2,28-30 helt. Även när antigenomiskt cDNA transfekteras, är effektiviteten av inkapsling av det rekombinanta RNA in RNP i transfekterade celler antagligen mycket låg. På grund av detta, räddnings protokoll för NDV innehåller ofta olika steg för amplifiering av de få virus-partiklar som frigörs från de ursprungligen transfekterade celler genom samodling av dem med permissiva celler och / eller av deninfektion i embryonerade ägg.

Före räddnings kan cDNA manipuleras genom standardkloningsförfaranden i syfte att alstra de önskade modifieringar. Även om specifika mutationer av olika genprodukter och regulatoriska sekvenserna av virus kan rättframt uppnås på detta sätt, många av det publicerade arbete som involverar rekombinant NDV har krävt tillägg av en ny transkriptionsenhet in i NDV-genomet. Liksom andra medlemmar av paramyxovirus familjen, kodar NDV genomet åtta olika proteiner i sex transkriptionsenheter, som differentiellt uttrycks beroende på deras placering i förhållande till 3 'änden på en minskande gradient avgörande för virusets livscykel ^1. På grund av detta måste platsen för den nya transkriptionsenheten inom genomet väljas omsorgsfullt för att uppnå en balans mellan uttrycket av transgenen och nedskrivning av viral replikation. Insättning mellan P-och M-gener har använts mest, tHough andra platser har också testats ^13,31.

Oavsett insatsen, kloning i NDV cDNA måste följa vissa regler för att generera en rescuable konstruktion: (i) varje ny gen som ska ingå i NDV genomet måste vara under kontroll av lämpliga signaler för den virala RNA-beroende-RNA polymeras. Dessa sekvenser måste tillsättas uppströms om ny öppen läsram (ORF) så polymeraset kan känna igen slutet av föregående genen (GE) och början av den nya transgenen (GS), åtskilda av en enda nukleotid intergeniska sekvensen (IG) . Tillägg av en giltig Kozak (K) sekvens för att förbättra eukaryota ribosomala översättning rekommenderas också för bättre främmande proteinuttryck ^32, (ii) effektiv replikering av NDV, som för de flesta medlemmar av Paramyxoviridae familjen är beroende av genomet längd är multipel av sex ^33, varför någon insättning i NDV har att följa den här "regeln om sex". Om nödvändigt required ytterligare nukleotider kan läggas nedströms den nya ORF, och (iii) bör kontrolleras sekvensen av transgenen för att hitta möjliga GE och GS som sekvenser som kan inverka räddnings effektivitet, transgen uttryck och / eller virus livskraft. Om det finns, måste dessa sekvenser avlägsnas genom tyst mutagenes. Alstring av rekombinant fullängds-cDNA efter ovannämnda reglerna är det första steget för att effektivt framställa en genetiskt modifierad NDV som beskrivs här.

I det system som alla DNA-konstruktioner är under kontroll av T7-RNA-polymeras-promotorn (Figur 3). Detta cytoplasmiska polymeras tillhandahålles i träns genom saminfektion med en rekombinant modifierad vaccinia-Ankara-viruset (MVA-T7) ^34. Fig. 3A visar pNDV-B1 plasmiden, vilken kodar för fullängds-antigenomiskt cDNA ^5. Figur 3B visar pTM1 plasmider kodar NP, P-och L-ORF. Plasmider pCITE-GFP, som kodar, under T7-promotorn, grönt fluorescerande protein (GFP), och pCAGGS ^GFP-18, som kodar samma ORF under kyckling beta aktin-promotorn ^35, används som kontroller. I detta protokoll visar vi det förfarande för att rädda rekombinant NDV från cDNA av den lentogena NDV-stammen Hitchner B1 ⁵ (Figur 4).

Protocol

1. Framställning av däggdjursceller (Figur 4A, Dag 1) Sträck HEp-2 eller A549-celler dagen före transfektion i 6-brunnars plattor. Densitet av cellerna bör nå 80-90% sammanflödet följande dag. Vanligtvis kan ett sammanflytande 100 mm skål delas upp i åtta brunnar (omkring 1 x 10 6 celler per brunn). För varje virus som ska räddas, bör 2-4 olika brunnar tas med, samt 2 extra brunnar för kontrollerna pCAGGS-GFP och pCITE-GFP 18, i syfte att ö…

Representative Results

Räddning av NDV är en väletablerad procedur, rutinmässigt i de laboratorier som har tillgång till den fullständiga cDNA av viruset. Emellertid gör den inneboende stokastiska naturen av förfarandet det svårt att uppnå 100% räddnings effektivitet. Övervaka de tidiga stegen i processen, speciellt transfektionseffektiviteten och infektionen med MVA-T7, hjälper att identifiera möjliga problem. Figur 5A visar standard transfektion och transfektion / infektionseffektivitetsvinster som är tillrä…

Discussion

Flera faktorer ska beaktas för att uppnå bra resultat samtidigt rädda NDV. Först den fullängds cDNA-konstruktion som ska användas måste utformas så att den funktionella införlivandet av nya transgener / ändringar i NDV genomet. Detta innebär, enligt ovan, att (i) lämplig gen end (GE), intergen (IG) och gen start (GS) sekvenser är att läggas till vid behov, (ii) det inte finns några förmodade GE eller GS-sekvenser i den utländska gen, och (iii) den fullständiga rekombinanta genomet följer den "reg…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.