Zebrafish में दृश्य तीक्ष्णता की एक मात्रात्मक उपाय के रूप में Optokinetic रिस्पांस

Summary

Zebrafish कई क्षेत्रों में अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण किया गया है. यहाँ हम एक दृश्य प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना और वयस्क zebrafish में एक कार्यात्मक दृश्य तीक्ष्णता की गणना करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन.

Abstract

Zebrafish आम तौर पर लार्वा मछली पर ध्यान केंद्रित या एक साधारण प्रतिक्रिया का प्रदर्शन पहले के तरीकों की लेकिन कई दृष्टि अनुसंधान के लिए एक सिद्ध मॉडल हैं. अभी हाल ही में zebrafish में वयस्क दृश्य व्यवहार ब्याज की बन गई है, लेकिन विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को मापने के तरीकों आने वाले नए हैं. इस अंतर को संबोधित करने के लिए, हम बार बार और सही ढंग से वयस्क zebrafish में दृश्य तीक्ष्णता को मापने के लिए optokinetic प्रतिक्रिया (OKR) का उपयोग करने के लिए एक पद्धति को विकसित करने के लिए निकल पड़े. यहाँ हम वयस्क zebrafish के दृश्य तीक्ष्णता दूरबीन और एक आँख का acuities दोनों सहित, मापा जा सकता है. मछली प्रक्रिया के दौरान नुकसान पहुंचाया नहीं गया है, क्योंकि दृश्य तीक्ष्णता समय की छोटी या लंबी अवधि में मापा और तुलना की जा सकती. यहाँ वर्णित दृश्य तीक्ष्णता माप अगर वांछित जल्दी से उच्च प्रवाह के लिए और अतिरिक्त दृश्य प्रक्रियाओं की अनुमति के लिए भी किया जा सकता है. विश्लेषण के इस प्रकार के दवा हस्तक्षेप पढ़ाई या रोग प्रगति की जांच के लिए अनुकूल है.

Introduction

Zebrafish (Danio rerio) के कारण अन्य रीढ़, उनके छोटे जीवन चक्र, और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित म्यूटेंट ^1,2 की उपलब्धता को उनके रेटिना की समानता के लिए दृश्य शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल हैं. optokinetic पलटा / प्रतिक्रिया / अक्षिदोलन (OKR) चिकनी पीछा और तेजी से saccade आँख आंदोलनों का एक संयोजन है. 60 से अधिक वर्षों के लिए चिकित्सकों OKR निष्पक्ष रोगियों में दृश्य तीक्ष्णता को मापने के लिए इस्तेमाल किया और शिशु दृश्य क्षमताओं को ^3-5 निर्धारित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है कि हो सकता है का प्रदर्शन किया है. पशुओं में OKR के पहले दर्ज उपयोग 1950 के दशक ⁶ में कबूतरों का उपयोग किया गया था. हाल ही में, OKR लार्वा zebrafish में दृश्य समारोह का आकलन करने और अक्सर एक दृश्य हानि ^1,2 है कि आनुवंशिक म्यूटेंट के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जाता है के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. OKR व्यापक रूप से लार्वा zebrafish में दृश्य समारोह का निर्धारण किया गया है, यह केवल हाल ही में वयस्क ज़ेबरा में प्रदर्शित किया गया है^7-10 मछली. Tappeiner द्वारा हाल ही में कागज एट अल. पारंपरिक रूप से चूहों के लिए इस्तेमाल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध optomotor प्रणाली का उपयोग करता है, OptoMotry, वयस्क zebrafish के दृश्य तीक्ष्णता भी विभिन्न कोणीय वेग ⁷ के पार, डिग्री प्रति 0.59 चक्र (सीपीडी) ~, काफी स्थिर बनी हुई है कि प्रदर्शित करने के लिए .

OKR लार्वा zebrafish पढ़ाई में काफी उपयोगी साबित हो गया है हालांकि, दृश्य व्यवहार के लिए अन्य तरीकों सफलता की डिग्री बदलती के साथ zebrafish वयस्कों में इस्तेमाल किया गया है. भागने प्रतिक्रिया परख दोनों रंजकता म्यूटेंट, उज्ज्वल प्रकाश स्थितियों ^11,12 में दृश्य प्रतिक्रियाओं को कम कर दिया, कि सूरजमुखी मनुष्य और रूबी zebrafish का प्रदर्शन किया. यह वही बच प्रतिक्रिया परख भी सफलतापूर्वक ¹³ साल की उम्र के 2 साल पर यद्यपि, रतौंधी डी म्यूटेंट की पहचान की है. हालांकि, बच प्रतिक्रिया परख खामियों के बिना नहीं है. यह एक सटीक दृश्य समारोह के लिए कारण बताना मुश्किल है और केवल एक सकल approximatio हैदृश्य परिवर्तन के एन – परिवर्तन की पहचान की है इससे पहले कि यह एक बड़े परिवर्तन लेता है, जिसका अर्थ है.

दृष्टिहीनता से ग्रस्त वयस्क zebrafish की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है कि एक अन्य विधि optomotor प्रतिक्रिया (OMR) ¹¹ है. इस परख में, मछली केंद्र में एक अपारदर्शी स्तंभ के साथ एक परिपत्र टैंक में रखा जाता है. काले और सफेद धारियों की टंकी के आसपास बारी बारी से और मछली पट्टी गति की दिशा में तैरने के साथ काम सौंपा है. भागने की प्रतिक्रिया की तरह, OMR वयस्क zebrafish के visuomotor क्षमताओं पर केंद्रित है. यह हालांकि इस तरह के lrp2/bugeye म्यूटेंट ¹⁴ के रूप में दृष्टि दोष, साथ मछली की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. lrp2/bugeye zebrafish प्रदर्शनी बफथैलेमोस, बुलंद intraocular दबाव, OMR कम, और प्रगतिशील रेटिना अध: पतन ^14,15.

कई अध्ययनों से अक्सर व्यक्तिपरक हैं और क्वांट नहीं किया जा सकता जो वयस्क zebrafish में visuomotor क्षमताओं का इस्तेमाल किया हैitatively का विश्लेषण किया. OKR का उपयोग करके, एक और निष्पक्ष वयस्क मछली का दृश्य तीक्ष्णता अध्ययन कर सकते हैं. हम शुरू में लार्वा पढ़ाई ¹ के लिए इस्तेमाल एक के बाद मॉडलिंग हमारे अपने OKR डिवाइस का निर्माण किया है. इस अध्ययन में हम OKR आँख और zebrafish में दूरबीन दृश्य तीक्ष्णता दोनों की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है.

Protocol

सभी पशु पालन और प्रयोगों को मंजूरी दे दी और संबंधित संस्था या अन्य कानूनी आवश्यकताओं के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाना चाहिए. 1. Zebrafish देखभाल एक 10 घंटा अंधेरे-14 घंटा प्रकाश चक्र 16 पर 28.5 डिग्री सेल्सियस पर मानक परिस्थितियों में zebrafish बनाए रखें. के बारे में 3 मछली / एल के एक टैंक घनत्व में वयस्क zebrafish रखें 2. Optokinetic प्रतिक्रिया (OKR) ड्रम घूर्णन एक 14.5 सेमी व्यास, समायोज्य प्रकाश तीव्रता सेटिंग (300-8,000 लक्स) के साथ एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक कंप्यूटर (चित्रा 1 ए) का उपयोग कर कस्टम OKR रिकॉर्डिंग उपकरण का निर्माण. एक बगल मॉनिटर पर एक जीवित फ़ीड उपलब्ध कराने और छवि पर कब्जा और रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देगा कि माइक्रोस्कोप के लिए एक कैमरा संलग्न. Accommo जाएगा जो एक कंप्यूटर से जुड़ा हुआ एक microcontroller का उपयोग कर घूर्णन ड्रम नियंत्रित करेंतारीख विभिन्न गति और दिशा सेलेक्शन. 2-3 मिनट के लिए 0.016% tricaine में मछली anesthetize और फिर बढ़त पर निलंबित आँखें और गहरे नाले के साथ एक छोटे से मंच पर मछली जगह है. मछली के शरीर पर एक पतली स्पंज / तौलिया रखें और यह immobilized रखने के लिए मछली पर मछली को समायोजित करने के लिए आकार फोम के 2-3 टुकड़े,, पिन. मछली की पूंछ के आंदोलन को सीमित मछली की चोट के कारण बिना स्थिरीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू हो पाया था, और सबसे अच्छा फोम का एक फ्लैट टुकड़ा का उपयोग कर हासिल की थी. (चित्रा 1 बी) OKR रिकॉर्डिंग डिवाइस के घूर्णन ड्रम के अंदर फिट बैठता है, एक बेलनाकार पानी से भरे टैंक के भीतर मछली स्थिति. लगभग 7.3 सेमी ड्रम के किनारे से आंखों के साथ, ईमानदार मछली की स्थिति के लिए मंच पर चुंबक का उपयोग. मछली कुछ ही मिनटों के भीतर संज्ञाहरण से पुनर्जीवित करना चाहिए – सामान्य श्वास फिर से शुरू होगा और यादृच्छिक आँख आंदोलनों मनाया जाना चाहिए. एक बस रखेंई घूर्णन ड्रम में डिग्री (सीपीडी) के अनुसार 0.07 चक्र की झंझरी और रोटेशन और वीडियो पर कब्जा शुरू करने के लिए कंप्यूटर नियंत्रण संलग्न (12 आरपीएम की गति इस पत्र के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन 8-16 आरपीएम की गति समान परिणाम देना चाहिए). एक प्रारंभिक OKR झंझरी आधार से हासिल हो जाने के बाद, संक्षेप में रोटेशन को थामने, और एक छोटे झंझरी (उच्च स्थानिक आवृत्ति) के साथ झंझरी जगह. एक OKR अब नहीं हासिल किया जा सकता है जब तक इस प्रक्रिया को दोहराएं. एक संशोधित सीढ़ी दृष्टिकोण के बाद एक OKR कारण होता है और फिर OKR के नुकसान को सत्यापित करने के लिए एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने में विफल रहा है कि झंझरी का उपयोग दोहराने कि छोटी से छोटी झंझरी के साथ जांचना. अंतिम झंझरी पहले लुप्त होने की घटना के सापेक्ष बदल अगर यह प्रक्रिया सबसे छोटी detectable झंझरी के लिए एक सच्चे प्रतिक्रिया सत्यापित करने के लिए दोहराया जा सकता है. विपरीत आंख से सटे धारियों पर एक काले प्लास्टिक occluder रखकर आँख तीक्ष्णता माप प्राप्त. (2.6-2.7 कदम) ऊपर प्रक्रिया को दोहराएँ. Occluder repositioning और फिर कदम 2.6-2.7 दोहरा द्वारा विपरीत आंख की तीक्ष्णता प्राप्त करते हैं. हर आंख सही तीक्ष्णता उपायों निम्न चरणों में गणना की जा सकती है, ताकि मछली टैंक के नीचे संदर्भ मापने पट्टी का उपयोग करके परीक्षण की प्रक्रिया के दौरान धारियों से है दूरी नोट. 3. दृश्य तीक्ष्णता को गिना सीपीडी की गणना के द्वारा दृश्य तीक्ष्णता प्राप्त करें: एक झंझरी के लिए लेंस के केन्द्र से दूरी है, और ज OKR (चित्रा 1C) मनाया गया, जिस पर छोटी से छोटी झंझरी में से एक चक्र की लंबाई है जहां. संयुक्त दृश्य तीक्ष्णता माप के लिए, औसतन छोड़ दिया और सही आंख दोनों से एक मूल्य प्रयोग किया जाता है.

Representative Results

OKR उपकरण की कार्यक्षमता ऊपर बताया और चित्रा में कम से कम रखरखाव के साथ 1 कार्यों के रूप में दिखाया OKR डिवाइस. पूंछ immobilizing, 2.3 कदम के रूप में विख्यात रिकॉर्डिंग के दौरान रोका मछली रखने के लिए महत्वपूर्ण है. पर्याप्त immobilized, मछली समय की लंबी अवधि के लिए OKR डिवाइस में रखा जा सकता है. अधिक डेटा के लिए प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए एकत्र किया जा सकता है, ताकि नतीजतन, देखभाल, प्रारंभिक स्थिरीकरण चरणों के दौरान लिया जाना चाहिए. दृश्य तीक्ष्णता माप दूरबीन OKR आसानी से सामान्य वयस्क मछली में हासिल की है. उपरोक्त प्रक्रिया का पालन करके एक कई उम्र के zebrafish (चित्रा 2) के लिए दृश्य acuities पा सकते हैं. हम दर्ज की सर्वश्रेष्ठ दूरबीन स्थानिक तीक्ष्णता 0.74 सीपीडी था. चित्रा 2 में उल्लेख किया, दूरबीन तीक्ष्णता आम तौर पर उम्र के साथ बढ़ जाती है (n = 46 = पी SPSS V14 उपयोग कर 0.002 एनोवा), लेकिन स्तरों बंदउम्र के बारे में 12 महीनों के बाद. जंगली प्रकार, हम उम्र से मिलान lrp2/bugeye मछली को 5 महीने पुराने जंगली प्रकार की मछली में मापा दृश्य तीक्ष्णता की तुलना में, हम lrp2/bugeye मछली काफी तीक्ष्णता (पी <0.001 कम था पाया गया कि: 0.49 ± 0.05 सीपीडी, n = 8; lrp2/bugeye: 0.35 ± 0.06, n = 10; एक्सेल का उपयोग कर छात्र की टी परीक्षण). दाहिनी आंख occluding द्वारा छोड़ा आंख के लिए दृश्य तीक्ष्णता ठीक इसके विपरीत निर्धारित किया जा सकता है. दूरबीन तीक्ष्णता की तुलना में, दूरबीन योग मानव दृष्टि 17 (चित्रा 3) की तरह ही मनाया जाता है. दूरबीन तीक्ष्णता आम तौर पर सही (ओवर ड्राफ्ट) या छोड़ दिया स्वतंत्र रूप से मापा (ओएस) acuities किसी से 5-10% बेहतर था. कुछ व्यक्तिगत मछली के लिए अंतर एक 25% सुधार था. चित्रा 1. OKR सिफारिशrding. ए) OKR डिवाइस समायोज्य प्रकाश तीव्रता सेटिंग (300-8,000 लक्स) के साथ ड्रम और माइक्रोस्कोप घूर्णन एक 14.5 सेमी व्यास के होते हैं. एक कैमरा एक आसन्न मॉनिटर पर एक जीवित फ़ीड प्रदान करता है. डिग्री (सीपीडी) के अनुसार जरूरत के रूप में घूर्णन ड्रम दक्षिणावर्त और वामावर्त दिशाओं और विनिमेय स्थानिक आवृत्ति बिजली दोनों में विभिन्न गति सेटिंग है डाला और हटा रहे हैं. बी) मछली सुरक्षित और घूर्णन ड्रम के केंद्र में रखा जाता है. सी) चक्र की गणना है सीपीडी = का उपयोग बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 2. दृश्य तीक्ष्णता उम्र के साथ बदलता है. ग्राफ 5 मापा स्वतंत्र दृश्य acuities से पता चलता है – उम्र में 15 महीने. दृश्य तीक्ष्णता आम तौर पर विकास के पहले वर्ष के दौरान बढ़ जाती है और फिर उम्र के 15 महीनों (पी = SPSS V14 उपयोग कर 0.002 एनोवा) पर थोड़ी दूर पूंछ. प्रत्येक बिंदु या तो 1 या कई मछली प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. दृश्य तीक्ष्णता साइकिल / डिग्री (सीपीडी) में मापा जाता है. (एन = कुल 46, 5 महीने में 8, 6 महीने में 4, 8 महीनों में 7, 9 महीनों में 6, 10 महीने में 11, 11 महीने में 2, 12 महीने में 2, और 15 महीने में 6). यहां क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए . चित्रा 3. द्विनेत्री दृश्य तीक्ष्णता योग प्रभाव. दूरबीन (कहां) दृश्य तीक्ष्णता अधिकार (ओवर ड्राफ्ट) या छोड़ दिया (ओएस) आँखों acuities की तुलना में आम तौर पर अधिक है. इस विशेष समूह में ओएस acuities काफी कम थे. (* = पी 0.006, एन = 8)jove.com/files/ftp_upload/50832/50832fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस अवसर पर मछली पानी की टंकी में बच सकता है. यह पूंछ को स्थिर करने के लिए महत्वपूर्ण है. मछली के शरीर पर एक पतली स्पंज / तौलिया के साथ ही उपयोग भी समय की लंबी अवधि के लिए निलंबित मछली रखने के लिए अमूल्य हो पाया था. हम मछली को नुकसान पहुँचाने के बिना इस प्रक्रिया का उपयोग कर अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए immobilized मछली रखने के लिए सक्षम थे. समय की यह राशि दूरबीन और दोनों एक आँख acuities पास करने के लिए पर्याप्त से अधिक है.

एक शारीरिक रूप से घूर्णन ड्रम या एक डिजिटल प्रदर्शन ^18-22 पेश करके प्रयोग कर के और कहीं वर्णित के रूप में झंझरी की प्रस्तुति भी किया जा सकता है. दोनों प्रकार के विशिष्ट फायदे और नुकसान है. हम दोनों लागत कारणों और तकनीकी विनिर्देशों के लिए शारीरिक रोटेशन का उपयोग करने के लिए चुना है. कंप्यूटर और इमेजिंग उपकरणों को छोड़कर, यहां वर्णित OKR डिवाइस के आसपास $ 150 के लिए बनाया जा सकता है.

OKR विज़ का निर्धारण करने का एक उद्देश्य साधन हैवयस्क zebrafish में यौन तीक्ष्णता. दर्शन के लिए कई अन्य visuomotor assays पिछले प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है और यह भारी उपयोग नहीं किया गया है, हालांकि भी electroretinogram सफलतापूर्वक, वयस्क zebrafish आँखों में किया गया है, जबकि वयस्क zebrafish OKR कई नए प्रयोगात्मक शर्तों के ²² के लिए दरवाजे खोलता है. इस अध्ययन नेत्र रोग मॉडल में दृश्य तीक्ष्णता अंतर की पहचान करने, समय के साथ दृश्य तीक्ष्णता बदलाव को मापने में OKR की उपयोगिता का प्रदर्शन किया, और एक आँख का दृश्य तीक्ष्णता का निर्धारण करने में किया गया है.

दिलचस्प है, वयस्क zebrafish दृष्टि मानव दृष्टि (20/20) की तुलना में जब लगभग 20/1, 000 (0.60 सीपीडी -0.3 logMAR में बदल जाती है जब) है. इस गरीब लग सकता है, zebrafish आँखें बहुत अच्छी तरह से अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल हैं. 6.5 पानी के सेमी, पॉली कार्बोनेट के कुछ मिलीमीटर, और हवा का एक और सेंटीमीटर के माध्यम से देखने का दृश्य कार्य के बावजूद, मछली काफी अच्छा प्रदर्शन! हम वयस्क zebrafish तीक्ष्णता ABO है कि पायाकेन्द्र शासित प्रदेशों. ²³ कंट्रास्ट उनके फोटोरिसेप्टर रिक्ति दिया भविष्यवाणी क्या होगा के 70% है कि इष्टतम मानव प्रदर्शन के साथ ~ 20/12, जो है के बारे में 80% 20/10 की भविष्यवाणी की, और वयस्क zebrafish में दृश्य क्षमता को मापने के लिए OKR तकनीक प्रभावशाली है ^{24 , 25.}

स्वतंत्र आंख दृश्य acuities मापने की तकनीक एक आंख का इलाज किया जा सकता है और अन्य एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है जिसमें पढ़ाई के लिए अनुमति होगी. इसके अतिरिक्त, मोतियाबिंद विकसित कि lrp2/bugeye या मछली के रूप में असममित आँख विकास के साथ मछली और अधिक सही नजर रखी जा सकता है. यह देखभाल सही धारियों को आंखों से दूरी को मापने के लिए और दृष्टि का पूरा क्षेत्र रोक देना किए जाने की जरूरत है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस तकनीक zebrafish दृश्य समारोह का अधिक सटीक और विशिष्ट उपायों के दरवाजे खोलने चाहिए.

Materials

Super Low Light Black White Video Security Camera	Super Circuits	PC164CEX-2	Any low light camera may be used
Arduino Duemilanove microcontroller	Adafruit Industries		The Arduino Uno is also compatible with the speed control software.
Tricaine Methanesulfonate	VWR	101107-950