Organite Transport en culture d'<em> Drosophila</em> Cellules: S2 Cell Line et neurones primaires.
Summary
Cellules S2 de drosophile et des neurones en culture sont de grands systèmes pour l'imagerie du transport motorisé organite in vivo. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour la culture des deux types de cellules, leur imagerie et d'analyse de transport.
Abstract
Des cellules S2 de Drosophila étalées sur une lamelle couvre-objet en présence de tous les longs processus non ramifiées de forme de médicaments de l'actine-dépolymérisation de microtubules uniformément remplis de polarisation. Organites se déplacent le long de ces processus par des moteurs de microtubules. Facile d'entretien, de sensibilité à la protéine ARNi knock-down et procédure efficace pour créer des lignées cellulaires stables rendre les cellules S2 de drosophile un système modèle idéal pour étudier le transport de marchandises par imagerie en temps réel. Les résultats obtenus avec des cellules S2 peuvent être en outre appliqués à un système plus physiologiquement pertinente: transport axonal dans les neurones primaires en culture à partir d'embryons de Drosophila dissociées. Des neurones en culture se développent de longues neurites remplis de microtubules groupés, très similaires aux processus S2. Comme dans les cellules S2, organelles dans des neurones en culture peuvent être visualisées soit par des colorants fluorescents spécifiques à l'organelle ou en utilisant des marqueurs d'organelles fluorescentes codées par l'ADN injecté dans des embryons précoces ou exprimé dans transgenic vole. Par conséquent, le transport des organites peut être facilement enregistré dans les neurones en culture sur des lamelles de verre en utilisant l'imagerie vivant. Nous décrivons ici les procédures pour la culture et la visualisation de transport de marchandises dans les cellules S2 de drosophile et les neurones primaires. Nous croyons que ces protocoles font deux systèmes accessibles pour les laboratoires qui étudient le transport de fret.
Introduction
Cellules S2 de drosophile ont gagné en popularité de plus en plus pour l'étude de nombreux processus cellulaires. Ces cellules ont été initialement obtenues à partir d'embryons à un stade avancé de trypsinisées OregonR Drosophila melanogaster et maintiennent des caractéristiques de type macrophage 1. Cellules S2 de Drosophila offrent de nombreux avantages par rapport à d'autres lignées cellulaires. Elles sont mises en culture à 25 ° C sans CO 2, et peuvent être visualisés pendant plusieurs heures à la température ambiante sans nécessiter de chauffage ou d'échange de gaz. Plus important encore, les cellules S2 de Drosophila sont très sensibles à un traitement ARNi permet une grande efficacité de knock-down des protéines d'intérêt. Les cellules S2 sont hautement transfectable et des lignées cellulaires stables peuvent être sélectionnés en moins de quatre semaines pour permettre l'expression ectopique stable de protéines d'intérêt. Les cellules S2 poussent normalement soit vaguement attachés mais pas étalés sur un ballon ou en suspension. Ils peuvent être amenés à se propager sur des lamelles prérevêtues avec une conca lectine végétalenavalin A (ConA). La périphérie des cellules de propagation est particulièrement mince et est idéal pour la microscopie de cellules vivantes donc. Des protocoles détaillés pour les cellules S2 de la culture, le traitement ARNi, l'imagerie par immunomarquage direct et la lumière peuvent être trouvés dans la littérature de 2,3. Notre laboratoire a adopté cellules S2 en tant que système modèle pour étudier le transport du fret à base de microtubules. Cellules S2 de Drosophila traités avec un médicament qui dépolymérise ou rompt la F-actine, tels que la cytochalasine D (CytoD), se développent de longs processus remplis de microtubules uniformément polarisées 4 -10, ce qui en fait un système idéal pour étudier le mouvement des marchandises le long des réseaux de microtubules. Différents paramètres de transport dans ces processus (c.-à-trajectoires. Longueurs, vitesses, directivité etc) peuvent être facilement mesurés en utilisant un logiciel de traces de particules automatisé, DiaTrack (Semasopht: http://www.microscopy.info/Organization/Details/4423; Dr . Pascal Vallotton: http://www.csiro.au/en/Organisation-Structure/Divisions/Mathematics-Informatics-and-Statistics/PascalVallotton.aspx # a4). Ces propriétés rendent les cellules S2 un système attrayant pour étudier le transport de cargaison le long des microtubules dans les cellules de culture de tissu.
Des expériences pilotes dans les cellules S2 peuvent être étendus à un modèle physiologique important des études de transport de marchandises dans la drosophile neurones primaires. Similaire à des cellules S2, les neurones mis en culture à partir d'embryons dissociées sont perméables aux petites molécules telles que des colorants et des inhibiteurs, et l'imagerie haute résolution en temps réel du transport des organites peuvent être effectuées dans des neurones à la température ambiante. En utilisant la drosophile fonds génétiques différents, nous pouvons examiner la fonction des gènes dans les neurones primaires par KO (mutations génétiques perte de fonction), knockdown (injection d'ARNdb ou expression) ou l'expression ectopique (mouches transgéniques). Plus précisément, la fragmentation des filaments d'actine en utilisant le traitement CytoD n'empêche pas la croissance des neurites, mais plutôt qu'ils poussent plus vite, et ainsi nous pouvons étudier microtubules dependent le transport des organites dans les neurones CytoD traités sans l'influence de filaments d'actine 11. Par conséquent, les cultures primaires de neurones combinent les avantages des cellules de culture de tissus et de voler la génétique, ce qui en fait un excellent système pour étudier le transport de fret dans un système pertinent physiologique 10,12. Depuis plusieurs maladies neurodégénératives familiales pourraient être causés par ou associées à des défauts de transport de marchandises (par exemple de la maladie de Parkinson 13, la maladie de Huntington 14, la maladie d'Alzheimer 15,16, la sclérose latérale amyotrophique / ALS 17, HMN7B et Perry syndrome 18,19, et Ataxie spinocérébelleuse type 5/SCA5 20), les cultures primaires de neurones peuvent être utiles dans l'analyse des effets de mutations spécifiques qui causent ces maladies sur le transport des microtubules dépendant.
Enfin, les propriétés importantes de transport des microtubules dépendant sont bien conservées entre les mammifères et les mouches, mais <em> Culture génétique et cellulaire chez la drosophile est moins cher et prend du temps, ce qui justifie l'utilisation de cellules de drosophile en culture pour l'étude des aspects essentiels de transport des organites dans des conditions normales et pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici des protocoles détaillés pour étudier le transport de fret microtubules dépendante dans les cellules S2 de drosophile et de la culture de neurones primaires. Les processus et les neurites S2 sont des structures remplies par groupés microtubules tableaux qui servent de pistes pour le transport des organites.
Deux stratégies sont généralement utilisées pour des organelles de l'étiquette: la transfection de vecteurs codant pour une protéine fluoresce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire Gelfand qui ont contribué à l'élaboration de ces protocoles. Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national de sciences générales médical des National Institutes of Health sous le numéro d'attribution R01GM052111 de VIG et par basque ministère du gouvernement de l'Éducation, des Universités et de la Recherche sous le numéro d'attribution BFI-2011-295 à UdC.
Materials
| Powder Insect cell medium (Schneider’s) | Sigma | S9895 |
| Insect –Xpress medium | Fisher | BW12730Q |
| Insulin | Sigma | I6634 |
| Penicillin | Research Products International | P93000 |
| Streptomycin | Research Products International | S62000 |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T7660-5G |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 |
| Concanavalin A | Sigma | C2010 |
| Cytochalasin D | VWR | IC15077105 |
| LysoTracker Red DND-99 | Molecular Probes | L7528 |
| 100 µm Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 |
| 25 mm Circle cover glass | VWR | 48380 080 |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-730 |
| Disposable pellet pestles with matching microtubes | Kimble Chase | 749520-0000 |
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