Høy gjennomstrømning Microinjections av Sea Urchin zygoter

Summary

Mikroinjeksjon er en vanlig teknikk som brukes til å levere DNA-konstruksjoner, mRNAs, morfolino antisens-oligonukleotider eller andre behandlinger inn i egg, embryoer og celler av forskjellige arter.

Abstract

Mikroinjeksjon inn i celler og embryoer er en vanlig teknikk som benyttes for å studere et bredt spekter av biologiske prosesser. I denne fremgangsmåten en liten mengde av behandlingsoppløsningen er lagt inn i en mikroinjeksjon nål som brukes for fysisk å injisere individuelle immobiliserte celler eller embryoer. Til tross for behovet for innledende opplæring for å utføre denne fremgangsmåten for high-throughput levering, mikroinjeksjon gir maksimal effektivitet og reproduserbar avgivelse av en lang rekke behandlingsløsninger (inkludert komplekse blandinger av prøvene) inn i celler, egg eller embryoer. Søknader til microinjections inkluderer levering av DNA-konstruksjoner, mRNA, rekombinante proteiner, gevinst på funksjon, og tap av funksjon reagenser. Fluorescent-eller kolorimetriske fargestoff tilsettes til den injiserte løsningen til å muliggjøre direkte visualisering av effektiv levering, samt et verktøy for pålitelig å normalisere mengden av avgitt løsning. Den beskrevne metoden gjør mikroinjeksjon av 100-400 kråkebolle zygotes innenfor 10-15 min.

Introduction

Effektiv og reproduserbar behandling levering er en av de viktigste metodiske utfordringer for forskerne. Flere metoder har blitt etablert for å forbigående leverer renseløsninger inn i egg, embryo, og cellene. Disse metodene inkluderer elektroporering (basert på et genererer transiente porene i membranen ved hjelp av korte elektriske pulser) ^1,2, lipofection (levering via fusjon av behandlings-holdige liposomer med membranen) ^1, mikropartikkel bombardement ¹ (DNA utfelles på micron -store metallpartikler som deretter brukes til å trenge inn i cellene ved høy hastighet), og transduksjon (virus benyttes som et leveringsmiddelet av transgener). For øyeblikket er mikroinjeksjon den eneste metode som har fordelen av å levere en hvilken som helst løsning med 100% effektivitet med minimale reagenser. Videre kan en enkelt injeksjon løsning være sammensatt av en kompleks blanding av behandlinger. Denne teknikken er blitt brukt til å vellykketly microinject egg og embryoer fra en rekke arter som kråkeboller ^3,4, sebrafisk ^5, mus ^6, frosk ^7, og storfe ⁸ samt enkeltceller i vevet kultur ^ni. Enkelt blastomeres injeksjoner med senere utviklingsstadier er også gjennomført ^10-12.

De nåværende fremgangsmåter for microinjections er basert på trykk-injeksjonsfremgangsmåten som først ble beskrevet av Hiramoto ^10, men har store fremskritt blitt gjort til optimalisering av prosessen. Utmerket mikroinjeksjon teknikker har blitt beskrevet andre steder ^11, og her beskriver vi en av de spesifikke metoder som i dag benyttes til microinject kråkebolle (Strongylocentrotus purpuratus) nylig befruktede egg. I over et århundre, har kråkeboller vært en verdifull eksperimentell modell ^15,16. Kråkeboller er evolusjonært nært knyttet til chordatar (inkludert oss) og analyse avderes genom avslørte at de inneholder alle de store gen familier som human ^17. De produserer et stort antall synkront utvikle gjennomsiktig embryo som lett kan manipuleres. Ved hjelp av kråkebolle som modellorganisme, har kråkebollen samfunnet bidratt til vår forståelse av befruktning prosessen ^18-21, cellebiologiske prosesser ^22-24, og genet regulatoriske nettverk (GRNs) ^25-28.

Mikroinjeksjon i kråkebolle zygotes krever flere trinn. Først eggene må være immobilisert før injeksjoner (beskrevet nedenfor). Mikroinjeksjon retter er belagt med protaminsulfat (PS), noe som skaper et positivt ladet overflate som de negativt ladede egg kan feste seg ^tre. Eggene dejellied ved inkubasjon i sur sjøvann (pH 5,15) i 10 min, etterfulgt av to vaskinger i naturlig sjøvann eller kunstig vann sjøen (pH 8,0). De dejellied eggene er nøye rodde i en rett linjei midten av PS belagt skål i nærvær av 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), som er nødvendig for å inhibere aktiviteten av ovoperoxidase som utskilles fra kortikale granulater av egget som følge av befruktning ^29. Dette trinnet er viktig for å hindre herding av befruktning konvolutt og legge til rette for mikroinjeksjon nål oppføring. Som et alternativ til 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syre (PABA) benyttes. Injeksjonsoppløsningen blir lagt inn i en mikroinjeksjon nål ved hjelp av spesialiserte microloading pipettespissen og montert på en holder festet til mikromanipulator og trykkenheten (fig. 1). Hver nål kan brukes til å microinject individuelle zygoter i flere eksperimenter på forskjellige dager. Mikroinjeksjon kan utføres i 10-15 min til de zygotes stivne. De zygoter ble deretter vasket med saltvann og kultivert ved 15 ° C. Når embryoene nå klekking blastula scenen, slipper de klekking enzym som fordøyer deler av fertilization konvolutt ³⁰ og tillate dem å naturlig løsne fra PS-belagt parabolen. Om nødvendig, kan embryoene bli forsiktig løsnet fra formen ved hjelp av et munn pipette eller Pasteur pipette ved forsiktig å blåse sjøvann mot embryoene. Den beskrevne metoden muliggjør effektiv og pålitelig mikroinjeksjon av 100-400 nylig befruktede egg på en enkelt rett, og gir en høy gjennomstrømming metode for nedstrøms analyser.

Protocol

En. Utarbeidelse av protaminsulfat (PS) Belagt Retter Forbered 1% oppløsning av protamin-sulfat (PS) ved tilsetning av 0,5 g PS til 50 ml deionisert, destillert vann (DDH 2 O) i et 50 ml konisk rør. Ryst godt ved høy hastighet på en benk-risteapparat ved romtemperatur i 1-2 timer for å sikre fullstendig oppløsning av PS. Denne løsningen kan lagres ved 4 ° C i minst 3 måneder (sørge for å oppløses fullstendig gel-lignende bunnfall før hver bruk) 3. Ta en hylse på 6…

Representative Results

GFP og mCherry reporter konstruerer var in vitro transkribert og microinjected inn de nylig befruktede egg. Embryoer ble inkubert ved 15 ° C i 24 timer (inntil blastula stadium) og avbildes ved bruk av Zeiss Observer Z1 mikroskop. Injeksjon av reporter konstruerer førte ikke til noen utviklingsmessige defekter (figur 6). For kvantifisering av fluorescerende signaler, ble bildet oppkjøpet utført ved lav forstørrelse (100X) til maksimalt fange fluorescerende piksler (Tall 6D-F).</str…

Discussion

Mikroinjeksjon er en kraftfull teknikk for å levere ulike behandlinger som DNA, mRNA, rekombinante proteiner, tap av funksjon og forsterkning av funksjons reagenser, fargestoffer og deres kombinasjoner i egg, embryoer og celler av forskjellige organismer ^1-7. Imidlertid bør flere hensyn tas i betraktning når man designer en mikroinjeksjon eksperiment.

Det er kritisk viktig å ta hensyn til løseligheten av den leverte behandling og injeksjonsvolumet. Dersom microinjected opplø…

Materials

Glass pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope Axiovert 40C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles