Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes
Summary
Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.
Abstract
Mikroinjektion in Zellen und Embryonen ist eine übliche Technik, die verwendet wird, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen zu studieren. Bei diesem Verfahren wird eine kleine Menge der Behandlungslösung in einer Mikroinjektionsnadel, die verwendet werden, um physisch injizieren einzelnen immobilisierten Zellen oder Embryonen geladen. Trotz der Notwendigkeit für die Erstausbildung dieses Verfahren für Hochdurchsatz-Lieferung durchzuführen, bietet die Mikroinjektion maximale Effizienz und reproduzierbare Lieferung einer Vielzahl von Behandlungslösungen (einschließlich komplexe Mischungen von Proben) in die Zellen, Eier oder Embryonen. Anwendungen auf Mikroinjektionen Zustellung von DNA-Konstrukte, mRNAs, rekombinante Proteine, Überfunktion, und der Verlust der Funktion Reagenzien. Leuchtstoff-oder farbmetrischen Farbstoff auf der injizierten Lösung gegeben, um sofortige Visualisierung der effizienten Auslieferung sowie ein Tool für zuverlässige Normalisierung der Menge der gelieferten Lösung zu ermöglichen. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Mikroinjektion von 100-400 Seeigel zygotes innerhalb von 10-15 min.
Introduction
Effiziente und reproduzierbare Behandlung Lieferung ist eine der wichtigsten methodischen Herausforderungen für Forscher. Mehrere Verfahren wurden eingerichtet, um vorübergehend liefern Behandlungslösungen in die Eier, Embryos, und Zellen. Diese Verfahren umfassen Elektroporation (basierend auf einer Erzeugungs transiente Poren in der Membran unter Verwendung von kurzen elektrischen Impulse) 1,2, Lipofektion (Lieferung durch die Fusion der Behandlung enthaltenden Liposomen mit der Membran) 1, 1 Mikropartikelbeschuss (DNA wird im Mikrometer präzipitiert großen Metallpartikel werden dann verwendet, um die Zellen mit hoher Geschwindigkeit zu durchdringen) und Transduktion (Viren als Träger zur Freisetzung von Transgenen verwendet werden). Im Moment ist die Mikroinjektion der einzige Ansatz, der den Vorteil hat, keine Lösung mit 100% Effizienz mit minimalem Reagenzien enthält. Darüber hinaus kann eine einzelne Injektion Lösung eines Komplexes Cocktail bestehend aus Behandlungen werden. Diese Technik wurde erfolgreich verwendet worden, umly microinject die Eier und Embryonen aus zahlreichen Arten wie Seeigel 3,4, Zebrafisch 5, 6 Maus, Frosch, 7, 8 und Rinder sowie einzelne Zellen in der Gewebekultur-9. Einzel Blastomeren Injektionen in späteren Entwicklungsstadien wurden auch durchgeführt, 10-12.
Die aktuellen Methoden der Mikroinjektionen auf der Druckinjektionsverfahren, das ursprünglich von Hiramoto 10 beschrieben wurde, basiert, aber große Fortschritte zur Optimierung dieses Prozesses hergestellt. Ausgezeichnet Mikroinjektion Techniken wurden an anderer Stelle 11 beschrieben, und hier beschreiben wir eines der spezifischen Methoden, die derzeit verwendet wird, um Seeigel (Strongylocentrotus purpuratus) neu befruchtete Eier microinject. Seit über einem Jahrhundert haben Seeigel ein wertvolles experimentelles Modell 15,16. Seeigel sind evolutionär eng mit Chor (uns) und die Analyse von verwandtenihr Genom zeigte, dass sie alle wichtigen Genfamilien wie das menschliche 17 enthalten. Sie produzieren eine große Anzahl von synchron Entwicklung transparenter Embryonen, die leicht manipuliert werden kann. Mit Seeigel als Modellorganismus hat die Seeigel-Community, um unser Verständnis der Befruchtung 18-21, zellbiologische Prozesse 22-24, und der Gen-regulatorischen Netzwerken (KNS) 25-28 beigetragen.
Mikroinjektion in Zygoten Seeigel sind mehrere Schritte erforderlich. Zuerst müssen die Eier vor Injektionen (unten beschrieben) immobilisiert werden. Mikroinjektion Speisen werden mit Protaminsulfat (PS), die eine positiv geladene Oberfläche, auf die die negativ geladenen Eier 3 haften schafft beschichtet. Die Eier werden durch Inkubation in saurem Meerwasser (pH 5,15) für 10 min dejellied, gefolgt von zwei Waschungen in natürlichem Meerwasser oder künstlichem Meerwasser (pH 8,0). Die dejellied Eier werden sorgfältig in einer geraden Linie gerudertin der Mitte der PS-beschichtete Schale in Gegenwart von 1 mM 3-Aminotriazol (3-AT), die erforderlich ist, um die Aktivität von Ovoperoxidase, die aus den kortikalen Granulat des Eies als Folge der Düngung 29 abgesondert wird hemmen. Dieser Schritt ist wichtig, um die Härtung der Befruchtung Hülle zu verhindern und Mikroinjektionsnadel Eingabe zu erleichtern. Als Alternative zu 1 mM 3-AT können 10 mM paraminobenzoic Säure (PABA) verwendet werden. Die Injektionslösung wird in eine Mikroinjektionsnadel, die spezialisierte Microloading Pipettenspitze geladen und auf einem Halter zu Mikromanipulator und Druckeinheit angebracht ist (Fig. 1) montiert. Jede Nadel können einzelne Zygoten in mehreren Versuchen an verschiedenen Tagen microinject werden. Mikroinjektion kann für 10-15 Minuten durchgeführt werden, bis die Zygoten aushärten. Die Zygoten werden dann mit dem Meerwasser und kultiviert bei 15 º C gewaschen Wenn die Embryonen erreichen Brut Blastulastadium, Brut Enzym, das Komponenten des fer verdaut geben sietilization Umschlag 30 und damit sie natürlich aus der PS-beschichtete Schale lösen. Falls erforderlich, können die Embryonen vorsichtig aus der Schüssel mit dem Mund ansaugen oder Pasteurpipette durch sanft weht Meerwasser auf die Embryonen gelöst werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Mikroinjektion von 100-400 frisch befruchteten Eier auf einem einzigen Gericht, die eine Hochdurchsatzverfahren für Downstream-Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroinjektion ist eine leistungsfähige Technik für die Bereitstellung von verschiedenen Behandlungen, wie DNA, mRNA, rekombinante Proteine, Funktionsverlust und Überfunktion Reagenzien, Farbstoffe und deren Kombinationen in Eier, Embryonen und Zellen von verschiedenen Organismen, 1-7. Allerdings sollten einige Überlegungen bei der Gestaltung einer Mikroinjektion Experiment gehalten werden.
Es ist sehr wichtig, um die Löslichkeit des zuge Behandlung und die Einspritzmenge zu …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Santiago Suarez für das kritische Lesen des Manuskripts und Betty Cowgill für Hilfe in der Fotografie. Wir danken auch den anonymen Gutachtern für ihre kritischen Rückmeldungen. Diese Arbeit wird von der Universität Delaware Research Fund unterstützt.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
Referências
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