공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합
Summary
우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.
Abstract
뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 뼈 조직의 세포 외 매트릭스에 포함 된 성장 인자이다. 따라서 치유와 드 노보 골 형성을 자극하는 조골 세포에 중간 엽 세포 분화의 트리거로 BMP-2의 역할. 비계와 함께 재조합 인간 BMP-2 (rhBMP-2)의 임상 프레 젠 테이션의 형태에 따라, 최근의 논쟁을 제기하고 양이 전달 될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 세포에 대한 생체 외 연구에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 우리는 이종 링커 이루어진 자기 조립 단분자막을 형성하는 방법을 설명하고, rhBMP-2의 공유 고정화를 구하는 후속 결합 단계를 나타낸다. 이 방법으로는 단백질의 생물학적 활성을 유지하면서, BMP-2의 지속적인 프레젠테이션을 달성하는 것이 가능하다. 사실, BMP-2의 표면 고정화는 불특정 광고를 방지하여 타겟 조사를 허용orption, 성장 인자의 양을 줄임과 동시에, 특히, 표면에서 제어되지 않는 방출을 방해. 세포가 공유 고정 된 rhBMP-2를 제시 표면에 노출되었을 때 BMP-2에 의해 트리거 모두 단기 및 장기의 신호 이벤트는 BMP-2 자극에 대한 세포 반응에 체외 연구를위한이 방법이 적합하다 일어나고있다.
Introduction
뼈 형태 형성 단백질 2 (BMP-2) 형질 전환 성장 인자 (TGF-β) 가족과 드 노보 골 형성 유도뿐만 아니라 배아 발달과 성인 동안 여러 조직의 조절기 역할을 1-3 항상성의 구성원입니다. 생물학적 활성 homodimeric BMP-2 단백질의 각 단량체는 매우 모든 BMP에 4에 보존되어있는 "시스테인 매듭"모티브가 포함되어 있습니다. 일곱 번째 시스테인이 두 단량체 5,6 사이의 분자간 결합을 형성, 이량에 관여하는 반면, 일곱 시스테인 잔기의 여섯, 각각의 단량체를 안정 분자 내 이황화 결합을 형성한다. 이것은 고도로 보존 된 시스테인 매듭은 BMP-2 단백질의 입체 구조를 정의하고 열, 변성제 및 산성 pH 7-9 대한 저항으로서 독특한 특성을 결정한다. BMP-2함으로써 신호 전달을 유도 세린 / 트레오닌 키나아제 막 관통 수용체 바인딩 <sup> 10-12. 수용체 올리고머의 모드에 따라 서로 다른 신호 전달 경로가 활성화되어 TGF 계통에 의존하는 통로가 Smad의 복잡한 핵 전좌와의 전사 활성에있는 수용체 인산화의 결과에 의해 활성화 된 반면 Smad의 독립적 인 신호 폭포는, P38 신호를 통해 알칼리 포스 파타 아제의 유도로 연결 이러한 분화의 억제 (ID) 12 ~ 14과 같은 특정 표적 유전자.
뼈, BMP-2, 따라서 치료 및 뼈의 드 노보 형성을 자극하는 골아 세포에 중간 엽 줄기 세포의 분화를 유도한다. 현재 재조합 BMP-2가 골절 사이트의 치유를 강화하기 위하여 임상 적으로 적용되는 표현. 뼈 조직 공학의 일반적인 전략은 로컬 배달 시스템에 비해 덜 침습적 주사 성장 인자의 사용이다. 그러나, 생체 내 연구 및 임상 응용 프로그램을 보여 그 짧은 생물학적 반감기, 불특정 LOCalization와 BMP-2의 빠른 현지 통관 여러 지역 자궁외 및 조직 문제 (15)가 발생할 수 있습니다. 따라서, 효과적인 프리젠 테이션, 물질 내에서 또는 상 BMP-2의 함정 수사 또는 고정을 얻으려면 대상 사이트에서 로컬 및 지속적인 전달을 위해 필요합니다. 지속 전달은 물리적 포착, 흡착 또는 이온 착물 (16)과 같은 비공유 결합 고정 방식으로 달성 될 수있다. 그러나, 그것은 알려져있다 분자 (17)의 변성의 표면에 단백질의 비특이적 흡착 할 수있다 결과. 성장 인자의 결합을 공유 결합의 경우, 지지체의 종류가 지난 십 년간 개발되어왔다. 예를 들어 단백질의 아미노 또는 카르복시기를 대상으로 관능 링킹 분자의 사용은 반드시 그 고정화를 달성하는 단백질 수정을 요구하지 않는 방식의 한 유형이다. 사실, 반면 단백질 변형 단백질 배향을 제어 이점을 제공한다인공 도메인, 펩타이드 태그 및 부위 특이 적 쇄의 도입은 성장의 생물학적 활성은 17 요인 변경할 수있다. 따라서, 인해 담체와의 상호 작용에 변성을 회피하는, 표면은 원하는 요소 (18)의 결합에 의해 다음에 링킹 분자의 자기 조립 단분자막 (SAM), 예를 들어, 미리 관능 화 될 수있다. 우리는 그것의 유리 아민의 잔류를 대상으로 공유 표면에 BMP-2를 고정시키기 SAM-기반 접근 방식을 사용하고 고정 된 단백질의 단기 및 장기 생물학적 활성 19 두를 유지하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 세포막에서 발생하고 골 형성 신호에 대한 책임 세포 내 신호를 조절하는 메커니즘에 체외 연구를위한 세포에 BMP-2를 제공하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 생리 활성 rhBMP-2와 기능화 표면의 준비에 대해 설명합니다. ; rhBMP-2 단백질의 2) 공유 고정화 금 표면에 관능 링커의 자기 조립 단분자막 (SAM)의 1) 초기 형성 :이 방법은 두 단계를 포함한다. 이전의 연구에서, 우리는 관능 링커 및 성장 인자의 효과적인 결합을 검증하고, 표면 고정화 rhBMP-2의 생물학적 활성 (19)를 유지 것을 보여 주었다. 고정화 된 형태로 제공 성장 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자신의 종류의 지원에 교수 JP 파츠 (생물 물리 화학과, 하이델베르크 대학교 및 새로운 재료 및 바이오 시스템학과, 지능형 시스템을위한 맥스 플랑크 연구소, 슈투트가르트) 감사합니다. 막스 플랑크 먼과 도이치 Forschungsgemeinschaft (EAC-A에 DFG SFB/TR79.)에서 재정 지원도 크게 인정합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma-Aldrich | 130672 | |
| 4-(dimethylamino)pyridin | Sigma-Aldrich | 522805 | |
| Acetone | AppliChem | A2282 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma-Aldrich | 674427 | |
| Dichlormethane | Merck | 106050 | |
| N,N'-dicyclohexylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D80002 | |
| Petroleum benzene | Merck | ||
| Glass coverslips | Carl Roth | M 875 | |
| Ethylacetate | AppliChem | A3550 | |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | |
| N,N-dimethylformamide | Carl Roth | T921 | |
| rhBMP-2 | R&D Systems | 355-BM | Carrier-free; expressed in E.coli |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS) | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Anti-rhBMP-2 | Sigma | B9553 | |
| Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Secondary antibody |
| Ampliflu Red assay | Sigma | 90101 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquid | Gibco | 41966 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F7524 | Sterile filtered, cell culture tested |
| Pen/Strep | Gibco | 15140 | |
| Trypsin 0.05% (1x) with EDTA 4Na | Gibco | 25300 | |
| Glycine (0.1 M) | Riedel-de Haën | 33226 | |
| IGEPAL CA-630 (1%) | Sigma | I8896 | Lysis buffer (ALP assay)19 |
| Magnesium chloride (MgCl2)(1 mM) | Carl Roth | HNO3.2 | |
| Zinc chloride (ZnCl2) (1 mM) | Carl Roth | 3533.1 | |
| p-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | S0942 | Phosphatase substrate |
| Anti-mysin heavy chain (MHC) | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | MF20 | Monoclonal antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A11001 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Equipment | |||
| Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequency 35 kHz | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | ||
| MED 020 Sputtercoating system | BAL-TEC AG | Coating conditions Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec |
|
| Tecan Infinite M200 Plate reader | Tecan |
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