Azionamento a distanza magnetica micrometrici Sonde per<em> In situ</em> Mappatura 3D di biofilm batterici Proprietà fisiche

Summary

Questo documento mostra un metodo originale basato sul comando a distanza di particelle magnetiche seminate in un biofilm batterico e lo sviluppo di pinzette magnetiche dedicate per misurare in situ le proprietà meccaniche locali del materiale vivente complesso costruito dai microrganismi alle interfacce.

Abstract

Adesione batterica e crescita su interfacce portano alla formazione di strutture tridimensionali eterogenei cosiddetti biofilm. Le cellule vive in queste strutture sono tenute insieme da interazioni fisiche mediate da una rete di sostanze polimeriche extracellulari. Biofilm batterici impatto molte attività umane e la comprensione delle loro proprietà è fondamentale per un migliore controllo del loro sviluppo – mantenimento o l'eradicazione – a seconda del loro esito avverso o benefico. Questo documento descrive una nuova metodologia che mira a misurare in situ le proprietà fisiche locali del biofilm che era stato finora esaminato solo dal punto di vista macroscopico e materiale omogeneo. L'esperimento qui descritto comporta l'introduzione di particelle magnetiche in un biofilm cresce a seme sonde locali che possono essere azionati a distanza senza disturbare le proprietà strutturali del biofilm. Pinzette magnetiche dedicati sono stati svipato per esercitare una forza definita su ciascuna particella incorporato nel biofilm. La configurazione è montato sulla scena di un microscopio per consentire la registrazione di immagini intervallati di periodo particella tirando. Le traiettorie delle particelle vengono estratti dalla sequenza e tirando i parametri viscoelastici locali sono derivati ​​da ciascuna curva spostamento particella, fornendo così la distribuzione 3D-spaziale dei parametri. Acquisendo informazioni sul profilo meccanico biofilm è essenziale dal punto di vista di un ingegnere per scopi di controllo biofilm ma anche dal punto di vista fondamentale per chiarire la relazione tra le proprietà architettoniche e la biologia specifica di queste strutture.

Introduction

Biofilm batterici sono comunità di batteri associati con superfici biologiche o artificiali ^1-3. Essi formano da un meccanismo di adesione crescita accoppiato con la produzione di matrice extracellulare ricca di polisaccaride che protegge e stabilizza l'edificio ^4,5. Questi biofilm non sono assemblaggi semplicemente passivi di cellule attaccati alle superfici, ma organizzati e complessi sistemi biologici dinamici. Quando i batteri passano da planctoniche allo stile di vita biofilm, cambiamenti nell'espressione genica e fisiologia cellulare sono stati osservati, nonché una maggiore resistenza agli antimicrobici e ospitare le difese immunitarie essere all'origine di molte infezioni persistenti e croniche ^6. Tuttavia, lo sviluppo controllato di queste strutture viventi offrono anche opportunità per applicazioni industriali e ambientali, come biorisanamento dei siti di rifiuti pericolosi, bio-filtrazione di acqua industriale o formazione di bio-barriere per la protezione del suolo e delle acque sotterranee da Contaminzione.

Mentre caratteristiche molecolari specifiche per modo biofilm della vita sono sempre descritti, i meccanismi che guidano lo sviluppo della comunità e la persistenza rimangono poco chiari. Usando i recenti progressi sulle misurazioni microscala utilizzando elettrochimica scansione o microscopia a fluorescenza, questi organismi viventi hanno dimostrato di presentare una notevole strutturale, chimica e biologica eterogeneità ^7. Tuttavia, fino ad ora, meccanica biofilm sono state principalmente esaminati macroscopicamente. Ad esempio, l'osservazione di stelle filanti biofilm deformazioni dovute a variazioni dei tassi di flusso del fluido ^8,9, compressione monoassiale di pezzi biofilm risalita dal terreno di agar o coltivate sul coperchio scorre ^10,11, taglio del biofilm raccolti dall'ambiente e poi trasferito in un parallelo Piastra reometro ^12,13, spettroscopia a forza atomica con una perla di vetro e rivestito con un biofilm batterico collegato a un cantilever AFM ¹⁴ o MICR dedicatoocantilever metodo per misurare la resistenza alla trazione di frammenti biofilm staccati ^15,16 sono state attuate negli ultimi dieci anni, fornendo informazioni utili sulla natura viscoelastica del materiale ^17. Tuttavia, sembra probabile che le informazioni sul biofilm in situ proprietà meccaniche è perso quando il materiale viene rimosso dal suo ambiente nativo, che è spesso il caso in questi approcci. Inoltre, il trattamento del biofilm come materiale omogeneo trova la informazioni sulla possibile eterogeneità delle proprietà fisiche all'interno della comunità. Pertanto, le esatte implicazioni della meccanica della struttura nella formazione di biofilm e le caratteristiche biologiche come l'espressione genica patterning o gradienti chimici possono difficilmente essere riconosciuti. Per progredire verso una descrizione microscala dei biofilm proprietà fisiche, sono necessari nuovi strumenti dedicati.

Dettagli Questo documento un approccio originale concepito per raggiungeremisurazione dei parametri meccanici locali in situ, senza disturbare il biofilm e consentendo disegno della distribuzione spaziale delle proprietà del materiale microscala e poi l'eterogeneità meccanica. Il principio dell'esperimento poggia sul drogaggio di un biofilm cresce con microparticelle magnetiche seguita dalla loro carico a distanza usando pinzette magnetiche nel biofilm maturo. Spostamento delle particelle in applicazione della forza magnetica controllata ripreso sotto il microscopio permette locale derivazione parametro viscoelastico, ogni particella di reporting proprio ambiente locale. Da questi dati, il profilo meccanica 3D del biofilm può essere disegnato, rivelando territoriali e ambientali condizione dipendenze. L'intero esperimento verrà mostrato qui su E. biofilm coli fatta da un ceppo geneticamente modificato che trasporta una derepressi plasmide F-like. I risultati dettagliati in un recente articolo ¹⁸ forniscono una visione unica degli interni della meccanica biofilm intatti.

Protocol

1. Batteri, Cultura e sospensione Preparazione Scegliere la colonia appena cresciuta da una piastra di agar lisogenia Broth (LB), inoculare in 5 ml di terreno LB liquido contenente 100 μ g / ml ampicillina e 7,5 μ g / ml di tetraciclina e incubare per 5 a 6 ore a 37 ° C su una piattaforma di agitazione. Poi, aggiungere 100 μ l di coltura batterica in 5 ml di terreno minimo (M63B1) supplementato con 0,4% di glucosio e le stesse concentrazioni di antibiotico. Incubare qu…

Representative Results

Un'analisi tipica fornirà la distribuzione spaziale dei parametri viscoelastici in scala micron su un biofilm vivere senza disturbare l'arrangiamento originale. I risultati tipici sono mostrati in figura 7 dove i valori di J 0 – la cedevolezza elastica – sono date in funzione del l'asse z lungo la profondità e l'asse y lungo una dimensione laterale del biofilm. Ogni punto corrisponde a una sfera che l'analisi della curva di creep ha fornito un valore di J 0. I…

Discussion

Questa particella magnetica semina e tirando attivato in situ mappatura 3D dei parametri viscoelastici di un biofilm cresce nel suo stato originale esperimento. Questo approccio ha rivelato l'eterogeneità meccanica del E. coli biofilm cresciuto qui e ha dato indizi per precisare le componenti del biofilm che sostengono i biofilm proprietà fisiche, suggerendo fortemente una implicazione fondamentale della matrice extracellulare e più precisamente il grado di reticolazione.

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Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin