El accionamiento a distancia magnética del micrométrica Sondas para<em> In situ</em> Mapping 3D bacterianas Biofilm Propiedades Físicas

Summary

Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases.

Abstract

La adhesión bacteriana y el crecimiento en las interfaces conducen a la formación de estructuras tridimensionales heterogéneos llamados biopelículas. Las células que habitan en estas estructuras se mantienen juntas por interacciones físicas mediadas por una red de sustancias poliméricas extracelulares. Los biofilms bacterianos impactan muchas actividades humanas y la comprensión de sus propiedades es fundamental para un mejor control de su desarrollo – el mantenimiento o la erradicación – en función de su resultado adverso o beneficioso. En este trabajo se describe una nueva metodología con el objetivo de medir in situ las propiedades físicas locales de la biopelícula que había sido, hasta ahora, el examen sólo desde una perspectiva de material macroscópico y homogénea. El experimento descrito aquí implica la introducción de partículas magnéticas en un biofilm creciente a las semillas sondas locales que pueden ser accionados de forma remota sin molestar a las propiedades estructurales de la biopelícula. Pinzas magnéticas fueron dedicados devellado para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula incrustado en la biopelícula. La instalación se monta en el escenario de un microscopio para permitir la grabación de imágenes con lapso de tiempo del período de partículas de arrastre. Las trayectorias de las partículas se extraen entonces de la secuencia de tracción y los parámetros viscoelásticos locales se derivan de cada curva de desplazamiento de partículas, proporcionando de este modo la distribución-3D espacial de los parámetros. Obtener conocimientos sobre el perfil mecánico biofilm es esencial desde el punto de vista de un ingeniero para el control de la biopelícula, sino también desde una perspectiva fundamental para aclarar la relación entre las propiedades arquitectónicas y la biología específica de estas estructuras.

Introduction

Los biofilms bacterianos son comunidades de bacterias asociadas a superficies biológicas o artificiales ^1-3. Se forman por un mecanismo de adhesión-crecimiento, junto con la producción de matriz extracelular rica en polisacáridos que protege y estabiliza el edificio ^4,5. Estos biofilms no son simplemente conjuntos pasivos de células pegadas a las superficies, pero los sistemas biológicos complejos dinámicos organizados y. Cuando las bacterias cambian de estilo de vida planctónica biofilm, no se observan cambios en la expresión genética y la fisiología celular, así como una mayor resistencia a los antimicrobianos y el anfitrión defensas inmunológicas son en el origen de muchas infecciones persistentes y crónicas ^6. Sin embargo, el desarrollo controlado de estas estructuras que viven también ofrecen oportunidades para aplicaciones industriales y ambientales, como la biorremediación de sitios de desechos peligrosos, bio-filtración de agua industrial o la formación de bio-barreras para proteger el suelo y el agua subterránea de contamiación.

Aunque cada vez se describen las características moleculares específicas para modo biofilm de la vida, los mecanismos que impulsan el desarrollo de la comunidad y persistencia siguen siendo poco claras. Uso de los recientes avances en las mediciones a microescala usando electroquímica de barrido o microscopía de fluorescencia, estas organizaciones vivos han sido demostrado que presentan una considerable estructural, química y la heterogeneidad biológica ^7. Sin embargo, hasta ahora, la mecánica de biopelícula se han examinado principalmente macroscópicamente. Por ejemplo, la observación de serpentinas biofilm deformación debida a las variaciones en las tasas de flujo de fluido ^8,9, compresión uniaxial de piezas de biopelícula elevación de medio de agar o cultiva en cubierta se desliza ^10,11, cizallamiento de biopelícula obtenida de el medio ambiente y después se transfirió a un paralelo reómetro de placas ^12,13, la espectroscopia de fuerza atómica utilizando una cuenta de vidrio y recubierto con una biopelícula bacteriana unida a un cantilever de AFM ¹⁴ o un micr dedicadoocantilever método para la medición de la resistencia a la tracción de los fragmentos de biofilm separados ^15,16 se han aplicado durante los diez últimos años, el suministro de información útil sobre la naturaleza viscoelástica del material ^17. Sin embargo, parece probable que la información sobre las propiedades mecánicas de biopelícula in situ se pierde cuando se retira el material de su entorno nativo, que era a menudo el caso en estos enfoques. Por otra parte, el tratamiento de la biopelícula como un material homogéneo no encuentra información sobre la posible distribución de las propiedades físicas de la comunidad. Por lo tanto, las implicaciones exactas de la mecánica de la estructura en la formación de biopelículas y rasgos biológicos tales como los patrones de expresión de genes o gradientes químicos casi no se pueden reconocer. Para avanzar hacia una descripción microscópica de las propiedades físicas del biofilm, se requieren nuevas herramientas dedicadas.

Este documento detalla un enfoque original concebido para lograrmedición de los parámetros mecánicos locales in situ, sin alterar la biopelícula y permitiendo dibujo de la distribución espacial de las propiedades del material a microescala y luego la heterogeneidad mecánica. El principio del experimento se basa en el dopaje de un biofilm creciente con micropartículas magnéticas seguido de su carga remota utilizando pinzas magnéticas en la biopelícula madura. El desplazamiento de partículas bajo la aplicación de fuerza magnética controlada fotografiado bajo el microscopio permite la derivación de parámetros viscoelástico local, cada partícula que informa sobre su propio entorno local. A partir de estos datos, el perfil mecánico 3D de la biopelícula se puede extraer, revelando condición dependencias espaciales y ambientales. Todo el experimento se muestra aquí en una E. biofilm coli hecha por una cepa genéticamente modificada que lleva un plásmido F-como desreprimida. Los resultados se detallan en un trabajo reciente ¹⁸ proporcionan una visión única del interior de la mecánica de biopelículas intactas.

Protocol

1. Cultura de las bacterias y Suspensión Preparación Elige una colonia recién crecido de una placa de agar Lisogenia caldo (LB), inocular en 5 ml de medio LB líquido que contiene 100 μ g / ml ampicilina y 7,5 μ g / ml de tetraciclina y se incuba durante 5-6 horas a 37 ° C en una plataforma de agitación. A continuación, añadir 100 μ l de cultivo bacteriano en 5 ml de medio mínimo (M63B1) suplementado con 0,4% de glucosa y las mismas concentraciones de antibióti…

Representative Results

Un análisis típico proporcionará la distribución espacial de los parámetros viscoelásticos en la escala de micras en una biopelícula que viven sin molestar a su disposición original. Los resultados típicos se muestran en la Figura 7, donde los valores de J 0 – se dan como una función del eje z a lo largo de la profundidad y de la eje y a lo largo de una dimensión lateral de la biopelícula – el cumplimiento elástica. Cada punto corresponde a una perla que el análisis de la curva …

Discussion

Esta partícula magnética de la siembra y tirando experimento habilitado pt la cartografía 3D in situ de los parámetros viscoelásticos de un biofilm creciente en su estado original. Este enfoque reveló la heterogeneidad mecánica de la E. coli biofilm crecido aquí y dio pistas para señalar los componentes de biopelículas que soportan las propiedades físicas del biofilm, lo que sugiere fuertemente una implicación fundamental de la matriz extracelular y con mayor precisión su grado de…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin