Fjern Magnetic Aktivering av micrometric prober for<em> In situ</em> 3D Kartlegging av biofilm fysiske egenskaper

Summary

Dette dokumentet viser en original metode basert på det fjernaktivering av magnetiske partikler sådd i en bakterie biofilm og utvikling av dedikerte magnetiske pinsett for å måle in situ de lokale mekaniske egenskapene til det komplekse levende materiale bygget av mikroorganismer på grenseflater.

Abstract

Bakteriell adhesjon og vekst av grenseflater føre til dannelse av tredimensjonale heterogene strukturer såkalte biofilm. Cellene bor i disse strukturene er holdt sammen av fysiske interaksjoner mediert av et nettverk av ekstracellulære polymere stoffer. Bakterielle biofilmer påvirke mange menneskelige aktiviteter og forståelsen av deres egenskaper er avgjørende for en bedre kontroll over sin utvikling – vedlikehold eller utrydding – avhengig av deres negative eller gunstig utfall. Dette dokumentet beskriver en ny metode tar sikte på å måle in situ de lokale fysiske egenskapene til biofilm som hadde vært til nå undersøkt bare fra et makroskopisk og homogent materiale perspektiv. Eksperimentet som er beskrevet her involverer innføring av magnetiske partikler i en voksende biofilm til frø lokale sonder som kan fjern aktuerte uten å forstyrre de strukturelle egenskaper av biofilm. Dedikerte magnetiske pinsett var utvikloped å utøve en bestemt kraft på hver partikkel innebygd i biofilmen. Oppsettet er montert på det stadium av et mikroskop for å muliggjøre opptak av time-lapse bilder av partikkel-trekking periode. De partikkel-baner blir så trukket ut fra trekke-sekvensen og de lokale viskoelastiske parametre blir utledet fra hver partikkel fortrengningskurve, for derved å gi den 3D-romlige fordelingen av parametrene. Å få innsikt i biofilm mekanisk profilen er viktig fra en ingeniørs synspunkt for biofilm styring, men også fra et grunnleggende perspektiv for å avklare forholdet mellom de arkitektoniske egenskaper og den spesifikke biologi av disse strukturene.

Introduction

Bakterielle biofilmer er samfunn av bakterier assosiert med biologiske eller kunstige overflater ^1-3. De danner med en adhesjons-vekstmekanisme kombinert med produksjon av polysakkarid-rik ekstracellulær matriks som beskytter og stabiliserer byggverk ^4,5. Disse biofilm er ikke bare passive sammensetninger av celler stakk til overflater, men organisert og dynamiske komplekse biologiske systemer. Når bakterier bytte fra planktoniske til biofilm livsstil, endringer i genuttrykk og cellefysiologi observert samt økt motstand mot antimikrobielle stoffer og vertens immunforsvar blir på opprinnelsen til mange vedvarende og kroniske infeksjoner ^seks. Men den kontrollert utvikling av disse levende strukturer tilbyr også muligheter for industri-og miljøapplikasjoner, for eksempel bioremediering av farlig avfall steder, bio-filtrering av industrielle vann eller dannelse av bio-barrierer for å beskytte jord og grunnvann fra contaminasjon.

Mens molekylære funksjoner som er spesifikke for biofilm livsstil blir stadig beskrevet, mekanismer som driver utvikling av lokalsamfunn og utholdenhet fortsatt uklare. Ved hjelp av den siste utviklingen på mikroskala målinger ved hjelp av scanning elektrokjemisk eller fluorescens mikroskopi, har disse levende organisasjoner vist seg å utvise betydelig strukturelle, kjemisk og biologisk heterogenitet ^7. Likevel, inntil nå, biofilm mekanikere har i hovedsak vært undersøkt makroskopisk. For eksempel, observasjon av biofilm streamere deformasjon på grunn av variasjoner i fluidstrømningshastigheter ^8,9, uniaksial kompresjon av biofilmstykker løftes fra agar medium eller dyrket på dekslet skyves ^10,11, skjær av biofilm oppsamlet fra omgivelsene og deretter overført til en parallell plate reometer ^12,13, atom kraft spektroskopi ved hjelp av en glassperle og belagt med en bakteriell biofilm festet til en AFM cantilever ¹⁴ eller en dedikert microcantilever metode for måling av strekkfasthet av frittliggende biofilm fragmenter ^15,16 har blitt gjennomført i løpet av de ti siste årene, noe som gir nyttig informasjon om viskoelastisk natur av materialet ^17. Imidlertid virker det sannsynlig at informasjon om in situ biofilm mekaniske egenskaper går tapt når materialet er fjernet fra sitt opprinnelige miljø, som ofte var tilfellet i disse tilnærmingene. Videre behandling av biofilmen som et homogent materiale som bommer på informasjon om den mulige heterogeniteten av de fysikalske egenskaper i samfunnet. Derfor kan de eksakte virkningene av struktur mekanikken i biofilmdannelse og biologiske egenskaper som genuttrykk mønster eller kjemiske gradienter neppe bli gjenkjent. For å gå videre mot en mikro beskrivelse av biofilm fysiske egenskaper, er pålagt nye dedikerte verktøy.

Denne artikkelen detaljer en original tilnærming unnfanget for å oppnåmåling av lokale mekaniske parametre i situ, uten å forstyrre den biofilm og muliggjøre uttak av den romlige fordelingen av mikromaterialegenskapene og deretter den mekaniske heterogenitet. Prinsippet om forsøket hviler på doping av en voksende biofilm med magnetiske mikropartikler etterfulgt av sin fjern lasting ved hjelp av magnetiske pinsett i den modne biofilm. Partikkel forskyvning under kontrollerte magnetisk kraft søknad fotografert under mikroskopet muliggjør lokale viskoelastisk parameter derivasjon, hver partikkel rapporterer sin egen lokale miljø. Fra disse dataene, kan 3D mekanisk profil av biofilm bli trukket, avslører romlige og miljømessige tilstand avhengigheter. Hele forsøket vil bli vist her på en E. coli biofilm laget av en genetisk konstruert stamme som bærer en derepressed F-lignende plasmid. Resultatene er beskrevet i en nyere artikkel ¹⁸ gir en unik visjon av det indre av intakte biofilm mekanikk.

Protocol

En. Bakterier Kultur og fjæring Forberedelse Pick et ferskt dyrket koloni fra en Lysogeny Broth (LB) agar plate, inokulere det i 5 ml flytende LB-medium inneholdende 100 μ g / ml ampicillin og 7,5 μ g / ml tetracyklin, og inkubere det i 5 til 6 timer ved 37 ° C på en risting plattform. Deretter tilsettes 100 μ l av bakteriekulturen i 5 ml minimal medium (M63B1) supplert med 0,4% glukose og de ​​samme antibiotiske konsentrasjoner. Inkuber denne ferske utvannet kul…

Representative Results

En typisk analyse vil gi den romlige fordelingen av de viskoelastiske parametre på micron skala på en levende biofilm uten å forstyrre den opprinnelige ordningen. Typiske resultater er vist i figur 7, hvor verdiene av J 0 – det elastiske compliance – er gitt som en funksjon av z-aksen langs dybden og på y-aksen langs en ​​lateral dimensjon av biofilm. Hvert punkt tilsvarer en perle som krype kurve analyse har gitt en J 0 verdi. Dataene viste at lokal samsvar varieres langs …

Discussion

Denne magnetiske partikler seeding og trekke eksperiment aktivert i situ 3D kartlegging av de viskoelastiske parametre for en voksende biofilm i sin opprinnelige tilstand. Denne fremgangsmåten viste den mekaniske heterogenitet av E. coli biofilm vokst her og ga ledetråder til å påpeke de biofilm komponenter som støtter de biofilm fysiske egenskaper, sterkt tyder på en grunnleggende implikasjon av den ekstracellulære matrise og mer presist dens grad av kryssbinding.

E…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin