Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em> In situ</em> Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

Summary

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Abstract

Aderência bacteriana e crescimento em interfaces levar à formação de estruturas tridimensionais heterogéneos chamados biofilmes. As células que habitam estas estruturas são mantidas juntas por interacções físicas mediadas por uma rede de substâncias poliméricas extracelulares. Biofilme bacteriano impactar muitas atividades humanas ea compreensão de suas propriedades é fundamental para um melhor controle do seu desenvolvimento – manutenção ou erradicação – dependendo de seu resultado adverso ou benéfico. Este artigo descreve uma nova metodologia com o objetivo de medir in situ as propriedades físicas locais do biofilme que tinha sido, até agora, examinada apenas a partir de uma perspectiva macroscópica de material e homogênea. A experiência aqui descrita envolve a introdução de partículas magnéticas num biofilme em crescimento sobre as sementes de sondas locais que podem ser comandadas à distância, sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Pinças magnéticas Dedicados foram desenvolvido para exercer uma força definida em cada partícula incorporada no biofilme. A instalação é montada sobre a plataforma de um microscópio, para permitir a gravação de imagens de lapso de tempo do período de puxar partícula. As trajectórias das partículas são, em seguida, extraiu-se a partir da sequência de puxar e os parâmetros locais viscoelásticas são derivados a partir de cada curva de deslocamento das partículas, proporcionando assim a distribuição 3D-espacial dos parâmetros. Ganhar insights sobre o perfil mecânico do biofilme é essencial do ponto de vista de um engenheiro de vista para fins de controle do biofilme, mas também a partir de uma perspectiva fundamental para esclarecer a relação entre as propriedades arquitetônicas e biologia específico dessas estruturas.

Introduction

Biofilme bacteriano são comunidades de bactérias associadas com superfícies biológicas ou artificiais ^1-3. Eles formam por um mecanismo de adesão-crescimento juntamente com a produção de matriz extracelular rica em polissacárido que protege e estabiliza o edifício ^4,5. Estes biofilmes não são assemblages simplesmente passivos de células aderidas a superfícies, mas organizado e sistemas biológicos complexos dinâmicos. Quando bactérias mudar de planctônicas de biofilme estilo de vida, as alterações na expressão de genes e fisiologia celular estão observada, bem como um aumento da resistência aos antibióticos e as defesas do hospedeiro imunes estando na origem de muitas infecções persistentes e crónicas ^6. No entanto, o desenvolvimento controlada dessas estruturas vivas também oferecem oportunidades para aplicações industriais e ambientais, como a biorremediação de depósitos de resíduos perigosos, bio-filtração de água industrial ou formação de bio-barreiras para proteger o solo e as águas subterrâneas de contaminção.

Embora as características moleculares específicos para forma de biofilme de vida estão cada vez mais descrito, os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento da comunidade e persistência permanecem obscuros. Usando os recentes avanços nas medidas microescala usando eletroquímica de varredura ou microscopia de fluorescência, essas organizações vivas têm sido mostrados para apresentar considerável estrutural, química e biológica heterogeneidade ^7. No entanto, até agora, a mecânica do biofilme foram principalmente examinados macroscopicamente. Por exemplo, a observação de flâmulas biofilme deformação devido a variações nas taxas de fluxo de fluido ^8,9, compressão uniaxial de peças de biofilme levantar de ágar ou cultivadas em cobertura desliza ^10,11, cisalhamento de biofilme coletado do ambiente e, em seguida, transferido para um paralelo placa reômetro ^12,13, espectroscopia de força atômica usando uma conta de vidro e revestido com um biofilme bacteriano ligado a um cantilever AFM ¹⁴ ou um micr dedicadoocantilever método para medir a resistência à tracção de fragmentos de biofilme destacadas ^15,16 foram aplicadas durante os últimos dez anos, fornecendo informação útil sobre a natureza viscoelástica do material ^17. No entanto, parece provável que a informação sobre as propriedades mecânicas de biofilme in situ é perdida quando o material é removido do seu ambiente nativo, que era muitas vezes o caso em tais abordagens. Além disso, o tratamento do biofilme como um material homogéneo, falha a informação sobre a possível heterogeneidade das propriedades físicas dentro da comunidade. Portanto, as implicações exatas da mecânica da estrutura na formação de biofilme e traços biológicos, como a expressão do gene padrões ou gradientes químicos dificilmente pode ser reconhecido. Para avançar no sentido de uma descrição microescala das propriedades físicas do biofilme, as novas ferramentas dedicadas são obrigatórios.

Este documento detalha uma abordagem original concebido para alcançarmedição dos parâmetros mecânicos locais in situ, sem perturbar o biofilme e permitindo que o desenho da distribuição espacial das propriedades dos materiais em microescala e, em seguida, a heterogeneidade mecânica. O princípio do ensaio baseia-se na dopagem de um biofilme cresce com micropartículas magnéticas, seguida da sua carga remota usando uma pinça magnéticos no biofilme maduro. Deslocamento de partículas sob controlado aplicação de força magnética fotografada ao microscópio permite derivação parâmetro viscoelástico local, cada partícula relatando seu próprio ambiente local. A partir destes dados, o perfil mecânico 3D do biofilme pode ser desenhada, revelando dependências condições espaciais e ambientais. Todo o experimento será mostrado aqui em um E. biofilme coli feito por uma cepa geneticamente modificado carregando um plasmídeo F-like desreprimidas. Os resultados detalhados em um artigo recente ¹⁸ fornecer uma visão única do interior da mecânica do biofilme intactas.

Protocol

1. Cultura das bactérias e preparação de suspensão Escolha de uma colónia recentemente crescido a partir de uma placa de ágar Lisogenia Broth (LB), inocula-o em 5 mL de meio líquido LB contendo 100 μ g / ml de ampicilina e 7,5 μ g / ml de tetraciclina e incube-para de 5 a 6 horas a 37 ° C em uma plataforma de agitação. Em seguida, adiciona-se 100 μ l de cultura bacteriana, em 5 ml de meio mínimo (M63B1) suplementado com 0,4% de glucose e as mesmas concentraç…

Representative Results

Uma análise típica irá proporcionar a distribuição espacial dos parâmetros viscoelásticos na escala mícron sobre um biofilme viver sem perturbar o seu arranjo original. Os resultados típicos são mostrados na Figura 7, em que os valores de J 0 – o cumprimento elástico – são dadas como uma função do eixo-z ao longo da profundidade e do eixo-y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a um cordão que a análise da curva de fluência tem proporcionado um…

Discussion

Esta partícula magnética semeadura e puxando experimento permitiu in situ mapeamento 3D dos parâmetros viscoelásticos de um biofilme crescendo em seu estado original. Esta abordagem revelou heterogeneidade mecânica da E. coli biofilme cultivadas aqui e deu pistas para apontar os componentes do biofilme que suportam as propriedades físicas de biofilme, o que sugere fortemente uma implicação fundamental da matriz extracelular e mais precisamente o seu grau de cross-linking.

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Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin