Este trabajo muestra una metodología original basada en el accionamiento a distancia de las partículas magnéticas sembradas en una biopelícula bacteriana y el desarrollo de las pinzas magnéticas específicas para medir in situ las propiedades mecánicas locales de la materia viva complejo construido por los microorganismos en las interfases.
La adhesión bacteriana y el crecimiento en las interfaces conducen a la formación de estructuras tridimensionales heterogéneos llamados biopelículas. Las células que habitan en estas estructuras se mantienen juntas por interacciones físicas mediadas por una red de sustancias poliméricas extracelulares. Los biofilms bacterianos impactan muchas actividades humanas y la comprensión de sus propiedades es fundamental para un mejor control de su desarrollo – el mantenimiento o la erradicación – en función de su resultado adverso o beneficioso. En este trabajo se describe una nueva metodología con el objetivo de medir in situ las propiedades físicas locales de la biopelícula que había sido, hasta ahora, el examen sólo desde una perspectiva de material macroscópico y homogénea. El experimento descrito aquí implica la introducción de partículas magnéticas en un biofilm creciente a las semillas sondas locales que pueden ser accionados de forma remota sin molestar a las propiedades estructurales de la biopelícula. Pinzas magnéticas fueron dedicados devellado para ejercer una fuerza definida sobre cada partícula incrustado en la biopelícula. La instalación se monta en el escenario de un microscopio para permitir la grabación de imágenes con lapso de tiempo del período de partículas de arrastre. Las trayectorias de las partículas se extraen entonces de la secuencia de tracción y los parámetros viscoelásticos locales se derivan de cada curva de desplazamiento de partículas, proporcionando de este modo la distribución-3D espacial de los parámetros. Obtener conocimientos sobre el perfil mecánico biofilm es esencial desde el punto de vista de un ingeniero para el control de la biopelícula, sino también desde una perspectiva fundamental para aclarar la relación entre las propiedades arquitectónicas y la biología específica de estas estructuras.
Los biofilms bacterianos son comunidades de bacterias asociadas a superficies biológicas o artificiales 1-3. Se forman por un mecanismo de adhesión-crecimiento, junto con la producción de matriz extracelular rica en polisacáridos que protege y estabiliza el edificio 4,5. Estos biofilms no son simplemente conjuntos pasivos de células pegadas a las superficies, pero los sistemas biológicos complejos dinámicos organizados y. Cuando las bacterias cambian de estilo de vida planctónica biofilm, no se observan cambios en la expresión genética y la fisiología celular, así como una mayor resistencia a los antimicrobianos y el anfitrión defensas inmunológicas son en el origen de muchas infecciones persistentes y crónicas 6. Sin embargo, el desarrollo controlado de estas estructuras que viven también ofrecen oportunidades para aplicaciones industriales y ambientales, como la biorremediación de sitios de desechos peligrosos, bio-filtración de agua industrial o la formación de bio-barreras para proteger el suelo y el agua subterránea de contamiación.
Aunque cada vez se describen las características moleculares específicas para modo biofilm de la vida, los mecanismos que impulsan el desarrollo de la comunidad y persistencia siguen siendo poco claras. Uso de los recientes avances en las mediciones a microescala usando electroquímica de barrido o microscopía de fluorescencia, estas organizaciones vivos han sido demostrado que presentan una considerable estructural, química y la heterogeneidad biológica 7. Sin embargo, hasta ahora, la mecánica de biopelícula se han examinado principalmente macroscópicamente. Por ejemplo, la observación de serpentinas biofilm deformación debida a las variaciones en las tasas de flujo de fluido 8,9, compresión uniaxial de piezas de biopelícula elevación de medio de agar o cultiva en cubierta se desliza 10,11, cizallamiento de biopelícula obtenida de el medio ambiente y después se transfirió a un paralelo reómetro de placas 12,13, la espectroscopia de fuerza atómica utilizando una cuenta de vidrio y recubierto con una biopelícula bacteriana unida a un cantilever de AFM 14 o un micr dedicadoocantilever método para la medición de la resistencia a la tracción de los fragmentos de biofilm separados 15,16 se han aplicado durante los diez últimos años, el suministro de información útil sobre la naturaleza viscoelástica del material 17. Sin embargo, parece probable que la información sobre las propiedades mecánicas de biopelícula in situ se pierde cuando se retira el material de su entorno nativo, que era a menudo el caso en estos enfoques. Por otra parte, el tratamiento de la biopelícula como un material homogéneo no encuentra información sobre la posible distribución de las propiedades físicas de la comunidad. Por lo tanto, las implicaciones exactas de la mecánica de la estructura en la formación de biopelículas y rasgos biológicos tales como los patrones de expresión de genes o gradientes químicos casi no se pueden reconocer. Para avanzar hacia una descripción microscópica de las propiedades físicas del biofilm, se requieren nuevas herramientas dedicadas.
Este documento detalla un enfoque original concebido para lograrmedición de los parámetros mecánicos locales in situ, sin alterar la biopelícula y permitiendo dibujo de la distribución espacial de las propiedades del material a microescala y luego la heterogeneidad mecánica. El principio del experimento se basa en el dopaje de un biofilm creciente con micropartículas magnéticas seguido de su carga remota utilizando pinzas magnéticas en la biopelícula madura. El desplazamiento de partículas bajo la aplicación de fuerza magnética controlada fotografiado bajo el microscopio permite la derivación de parámetros viscoelástico local, cada partícula que informa sobre su propio entorno local. A partir de estos datos, el perfil mecánico 3D de la biopelícula se puede extraer, revelando condición dependencias espaciales y ambientales. Todo el experimento se muestra aquí en una E. biofilm coli hecha por una cepa genéticamente modificada que lleva un plásmido F-como desreprimida. Los resultados se detallan en un trabajo reciente 18 proporcionan una visión única del interior de la mecánica de biopelículas intactas.
Esta partícula magnética de la siembra y tirando experimento habilitado pt la cartografía 3D in situ de los parámetros viscoelásticos de un biofilm creciente en su estado original. Este enfoque reveló la heterogeneidad mecánica de la E. coli biofilm crecido aquí y dio pistas para señalar los componentes de biopelículas que soportan las propiedades físicas del biofilm, lo que sugiere fuertemente una implicación fundamental de la matriz extracelular y con mayor precisión su grado de…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Agence Nationale pour la Recherche, programa PIRIbio Dynabiofilm y del CNRS programa Riesgo Interdisciplinario. Damos las gracias a Philippe Thomen por su lectura crítica del manuscrito y Christophe Beloin para la prestación del E. coli cepa utilizada en este trabajo.
Table 1: Reagents and cells | ||||
Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter | |
Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | ||
Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | ||
Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline | ||
Table 2: Capillaries and tubing | ||||
Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | ||
Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3mm | |
Table 3: Biofilm growth | ||||
Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | standard medium used to grow bacteria | |
M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria | ||
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose | |
Table 4: Electronics | ||||
Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | ||
Heater controller | World precision instruments | 300354 | ||
Function generator | Agilent technologies | 33210A | ||
Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | ||
Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | ||
Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | ||
Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | ||
Table 5: Optics | ||||
Inverted microscope | Nikon | TE-300 | ||
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth | ||
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. | |
Table 6: Image analysis | ||||
ImageJ | NIH – particle tracker plugin |