Fjärr Magnetisk Aktivering av mikrometer prober för<em> In situ</em> 3 Kartläggning av Bakteriella Biofilm Fysikaliska egenskaper

Summary

Detta dokument visar en originell metod som bygger på fjärrmanövreringen av magnetiska partiklar sådda i en bakteriell biofilm och utvecklingen av dedikerade magnetiska pincett för att mäta på plats den lokala mekaniska egenskaper i den komplexa levande material byggd av mikroorganismer vid gränssnitten.

Abstract

Bakteriell vidhäftning och tillväxt på gränssnitten leda till bildning av tredimensionella heterogena strukturer så kallade biofilms. Cellerna som håller till i dessa strukturer hålls samman genom fysikaliska växelverkningar som medieras av ett nätverk av extracellulära polymera substanser. Bakteriella biofilmer påverkar många mänskliga aktiviteter och förståelsen av deras egenskaper är avgörande för en bättre kontroll av deras utveckling – underhåll eller utrotning – beroende på negativ eller positiv utgång. Detta dokument beskriver en ny metod som syftar till att mäta på plats den lokala fysiska egenskaper biofilmen som varit hittills undersökt endast från en makroskopisk och homogent material perspektiv. Experimentet som beskrivs här består i att införa magnetiska partiklar i en växande biofilmen på utsäde lokala prober som kan fjärr manövreras utan att störa de strukturella egenskaperna hos biofilmen. Dedikerade magnetiska pincett var utveckvecklade för att utöva en bestämd kraft på varje partikel inbäddad i biofilmen. Konfigurationen är monterad på scenen av ett mikroskop för att möjliggöra registrering av tidsförlopp bilder av den partikel dragande perioden. Partikel banor är sedan utvinns ur dragsekvensen och de lokala viskoelastiska parametrar härrör från varje partikel förskjutningskurvan, vilket ger 3D-rumsliga fördelningen av parametrarna. Att få insikt i biofilmen mekaniska profilen är viktigt ur en ingenjör synvinkel för biofilm kontrollsyfte, men också från en grundläggande perspektiv för att klargöra förhållandet mellan de arkitektoniska egenskaper och den specifika biologin av dessa strukturer.

Introduction

Bakteriella biofilmer är samhällen av bakterier som följer med biologiska eller artificiella ytor ^1-3. De bildas genom en vidhäftningstillväxtmekanism i kombination med framställning av polysackarid-rik extracellulär matris som skyddar och stabiliserar den byggnad ^4,5. Dessa biofilmer är inte bara passiva assemblage av celler fastnat på ytor, men organiseras och dynamiska komplexa biologiska system. När bakterier byter från plankton till biofilmen livsstil, förändringar i genuttryck och cellfysiologi iakttas samt ökad resistens mot antimikrobiella och värd immunförsvar vara till grund för många långlivade och kroniska infektioner ^6. Men en kontrollerad utveckling av dessa levande strukturer erbjuder även möjligheter för industri-och miljöapplikationer, till exempel biologisk rening av farligt avfall platser, bio-filtrering av industrivatten eller bildning av biologiska barriärer för att skydda mark och grundvatten från förorenade områdenation.

Medan molekylära egenskaper som är specifika för biofilm livsstil allt oftare beskrivs, de mekanismer som driver samhällsutvecklingen och uthållighet fortfarande oklara. Med hjälp av de senaste framstegen på mikroskala mätningar med hjälp av scanning elektrokemiska eller fluorescensmikroskopi, har dessa levande organisationer visat sig uppvisa betydande strukturell, kemisk och biologisk heterogenitet ^7. Men fram till nu, biofilm mekanik har huvudsakligen undersökts makroskopiskt. Exempelvis observation av biofilm streamers deformation på grund av variationer i fluidflödeshastigheter ^8,9, enaxlig kompression av biofilm bitar lyfta från agarmedium eller odlas på täckglas ^10,11, skjuvning av biofilm uppsamlades från omgivningen och överförs sedan till en parallell tallrik reometer ^12,13, atomkrafts spektroskopi med hjälp av en glaspärla och belagd med en bakteriell biofilm bifogas en AFM fribärande ¹⁴ eller en dedikerad MICRocantilever metod för mätning av draghållfasthet av fristående biofilmfragment ^15,16 har genomförts under de tio senaste åren, att ge användbar information om den viskoelastiska materialets natur ^17. Men det verkar troligt att information om in situ biofilm mekaniska egenskaper förloras när materialet tas bort från dess naturliga miljö, vilket ofta är fallet i dessa metoder. Dessutom är behandlingen av den biofilm som ett homogent material missar informationen om eventuell heterogenitet av de fysiska egenskaperna i samhället. Därför kan de exakta konsekvenserna av strukturmekanik i biofilmbildning och biologiska egenskaper såsom genuttryck mönstring eller kemiska gradienter knappast erkännas. Framsteg mot ett mikro beskrivning av biofilm fysikaliska egenskaper, nya dedikerade verktyg behövs.

Detta dokument detaljer ett original metod utformades för att uppnåmätning av lokala mekaniska parametrar in situ utan att det stör biofilmen och möjliggör ritning av den rumsliga fördelningen av de mikroskala materialegenskaper och sedan den mekaniska heterogenitet. Principen av experimentet vilar på dopning av en växande biofilmen med magnetiska mikropartiklar följt av deras fjärrladdning medelst magnetiska pincett i den mogna biofilm. Partikel förskjutning under kontrollerade magnetiska kraften ansökan avbildas i mikroskop möjliggör lokala viskoelastiska parametrar härledning, varje partikel rapporterar sin egen närmiljö. Från dessa data kan den 3D mekaniska profilen av biofilmen dras, avslöjar rumsliga och goda miljöförhållanden beroenden. Hela experimentet kommer att visas här på ett E. coli biofilm görs av en genetiskt modifierad stam bär en derepressed F-liknande plasmid. Resultaten beskrivs i en nyligen papper ¹⁸ ger en unik vision av det inre av intakta biofilm mekanik.

Protocol

1. Bakterier Kultur och Suspension Förberedelse Pick a nyligen odlas koloni från en Lysogeny Broth (LB)-agarplatta inokuleras den i 5 ml flytande LB-medium innehållande 100 μ g / ml ampicillin och 7,5 μ g / ml tetracyklin och inkubera det i 5 till 6 timmar vid 37 ° C på en platta. Sedan till 100 μ liter av bakteriekulturen i 5 ml minimal-medium (M63B1) kompletterat med 0,4% glukos och samma antibiotikakoncentrationer. Inkubera detta nyligen utspädd kultur över na…

Representative Results

En typisk analys kommer att ge den geografiska fördelningen av de viskoelastiska parametrar i micron skala på en levande biofilm utan att störa den ursprungliga arrangemang. Typiska resultat visas i fig 7 där värdena på J 0 – det elastiska iakttagen – anges som en funktion av z-axeln längs djupet och av y-axeln längs en ​​tvärgående dimensionen av biofilmen. Varje punkt motsvarar en pärla som krypkurva Analysen har givit J 0 värde. Data visade att lokala överensst?…

Discussion

Denna magnetpulver sådd och dra experiment aktiverat på plats 3D-kartläggning av de viskoelastiska parametrar för en växande biofilm i originalskick. Detta tillvägagångssätt visade den mekaniska heterogenitet E. coli biofilm odlas här och gav ledtrådar för att peka ut de biofilm komponenter som stöder biofilm fysikaliska egenskaper, starkt tyder på en grundläggande konsekvens av den extracellulära matrisen och närmare bestämt dess grad av tvärbindning.

Erk…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin