غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار
Summary
نشاط الخلايا العصبية واحد من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار يمكن دراستها عن طريق الفصل بين الخلايا العصبية من مناطق محددة في الدماغ واستخدام الغشاء الفلورسنت التصوير صبغ المحتملة. من خلال ردود اختبار للتغيرات في الجلوكوز، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حساسية الجلوكوز من الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي.
Abstract
وغالبا ما يتم إجراء دراسات من نشاط الخلايا العصبية باستخدام الخلايا العصبية من القوارض أقل من 2 شهرا من العمر بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة بزيادة النسيج الضام، وانخفضت قابلية الخلايا العصبية التي تحدث مع التقدم في العمر. هنا، نحن تصف منهجية لتفكك الخلايا العصبية طائي صحية من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار. القدرة على دراسة الخلايا العصبية من الفئران البالغات من العمر يسمح باستخدام نماذج المرض التي تظهر في سن متأخرة، وربما يكون أكثر دقة تنمويا للدراسات معينة. التصوير مضان من الخلايا العصبية فصلها يمكن استخدامها لدراسة النشاط من السكان من الخلايا العصبية، بدلا من استخدام الكهربية لدراسة الخلايا العصبية واحدة. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة السكان غير متجانسة في الخلايا العصبية التي نوع الخلايا العصبية المرجوة أمر نادر الحدوث مثل الجلوكوز الاستشعار عن الخلايا العصبية طائي. نحن استخدام غشاء المحتملة التصوير صبغ الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي لدراسة ردودهم على تشاnges في الجلوكوز خارج الخلية. ويعتقد أن الخلايا العصبية الجلوكوز الاستشعار للعب دور في التنظيم المركزي لتوازن الطاقة. القدرة على دراسة استشعار الجلوكوز في القوارض الكبار مفيد بشكل خاص منذ هيمنة الأمراض المتصلة توازن الطاقة المختلة وظيفيا (على سبيل المثال. السمنة) تزيد مع تقدم العمر.
Introduction
الدماغ وينظم توازن الطاقة من خلال الغدد الصم العصبية والجهاز العصبي اللاإرادي. ما تحت المهاد بطني إنسي (VMH)، التي تتألف من نواة بطني إنسي (VMN) والنواة المقوسة (ARC)، المهم لتنظيم المركزي للتوازن الطاقة. الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز المتخصصة، ضمن VMH، ربط نشاط الخلايا العصبية الطرفية والجلوكوز التوازن 1. هناك نوعان من السكر في الخلايا العصبية الاستشعار؛ الجلوكوز متحمس (GE) زيادة الخلايا العصبية في حين الجلوكوز مستعمل (GI) الخلايا العصبية تقليل نشاطهم مع زيادة الجلوكوز خارج الخلية. يتم دراسة الخلايا العصبية VMH الجلوكوز الاستشعار عن بعد باستخدام عموما الكهربية أو الكالسيوم / غشاء المحتملة التصوير صبغة حساسة.
تعتبر تقنية المشبك التصحيح الكهربية ليكون المعيار الذهبي في دراسة خارج الحي نشاط الخلايا العصبية. في هذه التقنية، يتم إرفاق micropipette الزجاج الكهربائي لغشاء الخلية عن طريق مقاومة عالية(GΩ) الختم. أقطاب التصحيح المشبك السماح تسجيل الوقت الحقيقي من عمل محتمل تردد (الشبك الحالية) أو تصرف أيون (المشبك الجهد) التغييرات داخل الخلايا العصبية واحدة. بينما توفر تقنية المشبك التصحيح معلومات مفصلة بشأن التغييرات في المواصلة محددة القناة الايونية، والعيب الرئيسي هو أن الخلايا العصبية واحد فقط قد لوحظ في وقت واحد. يستغرق حوالي 30-45 دقيقة من تسجيل واحد للتحقق من أن يتم تسجيل من الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز حتى قبل البدء في العلاج التجريبي محددة. علاوة على ذلك، GI وGE الخلايا العصبية تتكون <20٪ من مجموع السكان العصبية VMH. مما يضاعف هذه المسألة هو عدم وجود، في العديد من الحالات، من علامة الخلوية لتحديد هذه الخلايا العصبية. وبالتالي، فمن الواضح أنه على الرغم من توفير المعلومات الكهربائية القيمة التي تقنيات أخرى لا يمكن، تحليل المشبك التصحيح شاقة، تستغرق وقتا طويلا والعائد المنخفض.
استخدام التصوير مضان من الخلايا العصبية VMH فصلها يسمح لدراسة جين تاوndreds من الخلايا العصبية في وقت واحد. الأصباغ الحساسة الكالسيوم يمكن استخدامها لقياس التغيرات الكالسيوم داخل الخلايا، والتي ترتبط بشكل غير مباشر للتغيرات في نشاط الخلايا العصبية. وتستخدم الأصباغ الحساسة غشاء المحتملة لرصد التغيرات المحتملة الغشاء. قياس إمكانات الغشاء الخلوي هو مؤشر أكثر مباشرة من نشاط الخلايا العصبية مقارنة للتغيرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. علاوة على ذلك، غشاء المحتملة صبغة (MPD) التصوير يحتمل بالكشف عن التغيرات الصغيرة في غشاء المحتملة حيث لا يتم تبديل عمل اطلاق النار المحتملة، وربما لا تغيير مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. كل من هذه تقنيات التصوير مضان وقد استخدمت لدراسة الخلايا العصبية VMH الاستشعار الجلوكوز من الفئران الأحداث 2-7. بينما النتائج هي أقل تفصيلا من تلك التي حصلنا عليها مع المشبك التصحيح الكهربية، وقوة من تجارب التصوير هو أنها تقيم في الوقت نفسه عدد كبير من الخلايا التي تشمل حتما عدد كبير من الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز. MPD ط التصويرق مفيدة بشكل خاص لدراسة الخلايا العصبية التي هي GI المترجمة في جميع أنحاء VMH بأكمله أكثر توحيدا، وبالتالي توفير السكان الكافية للدراسة في VMH فصلها (~ 15٪ GI). في المقابل، حين تكون مترجمة الخلايا العصبية GE المكتظة إلى بطناني-VMN وخلية المنطقة الفقيرة بين مركز البحوث الزراعية وVMN، فإنها لا تمثل عددا كبيرا من الخلايا العصبية داخل VMH (<1٪ GE). علاوة على ذلك، من خلال دراسة الخلايا العصبية معزولة، يتم استبعاد نجمي والآثار قبل المشبكي. هذا يمكن أن يكون ميزة في دراسة الآثار الأولى أجل الخلايا العصبية، فضلا عن وضع غير مؤات حيث يتم فقدان اتصالات والعمليات الفيزيولوجية.
وهناك عامل يحد في كل الكهربية المشبك التصحيح وMPD / التصوير الكالسيوم صبغ هو الحاجة إلى استخدام الحيوانات الأصغر سنا (على سبيل المثال. الفئران أو الجرذان <8 أسابيع من العمر). هذا هو في الغالب بسبب زيادة النسيج الضام في تركيبة مع انخفاض قابلية الخلايا العصبية الذي يحدث مع تقدم العمر. في الدماغ شريحة الكهربية عشيقالمنشأ، وزيادة الأنسجة الضامة يجعل الأمر أكثر صعوبة لتصور الخلايا العصبية. زيادة النسيج الضام أيضا يجعل من الصعب فصل عدد كبير من الخلايا العصبية السليمة للدراسات التصوير. علاوة على ذلك، الخلايا العصبية من الحيوانات الأصغر يعيش لفترة أطول خلال إما تسجيل المشبك التصحيح أو التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام الفئران الشابة يمكن أن يكون وجود قيود كبيرة. نشاط الخلايا العصبية و / أو الردود على الناقلات العصبية أو المواد الغذائية المتداولة تغيير مع تقدم العمر. على سبيل المثال، منذ يرتبط ارتباطا وثيقا توازن الطاقة الحالة الإنجابية، وتنظيم الخلايا العصبية طائي توازن الطاقة قد تستجيب بشكل مختلف في مرحلة ما قبل مباراة الحيوانات تال للبلوغ. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأمراض تتطلب المعالجة على المدى الطويل أو لا تظهر حتى مرحلة البلوغ. الأمثلة على هذه الأمراض هي السمنة الغذائية أو السكري من النوع 2 السكري. ويعتقد أن الخلايا العصبية منذ الاستشعار الجلوكوز لتلعب دورا في هذه الأمراض وضعنا منهجية لزراعة الخلايا العصبية بنجاح صحية الكبار VMH لاستخدامها في التصوير إكسب MPDeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
المفتاح لتكون قادرة على دراسة نشاط الخلايا العصبية من الفئران الكبار هو القدرة على فصل الخلايا العصبية السليمة. تفكك الخلايا العصبية طائي من الفئران الكبار هو أكثر صعوبة في عدة خطوات أساسية في البروتوكول مقارنة مع الخلايا العصبية من الفئران الأحداث. تغلبنا على هذه ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619، المعاهد الوطنية للصحة R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referências
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
