Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing
Summary
La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.
Abstract
Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.
Introduction
El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de glucosa. Neuronas de detección VMH glucosa se estudian generalmente usando electrofisiología o calcio / potencial de membrana de formación de imágenes colorante sensible.
La técnica de patch clamp electrofisiológico se considera el estándar de oro en el estudio ex vivo de la actividad neuronal. En esta técnica, un electrodo de micropipeta de vidrio está unido a la membrana celular a través de una alta resistencia(GΩ) sello. Electrodos de patch clamp permiten la grabación en tiempo real de la acción potencial de la frecuencia (pinza de corriente) o conductancia de iones (fijación de voltaje) cambia dentro de una sola neurona. Mientras que la técnica de patch clamp proporciona información detallada con respecto a los cambios en las conductancias de los canales de iones específicos, un gran inconveniente es que sólo una neurona puede observado a la vez. Se tarda aproximadamente 30 a 45 min de la grabación para comprobar que uno está grabando desde una neurona detección de glucosa, incluso antes de comenzar un tratamiento experimental específico. Por otra parte, las neuronas GI y GE comprenden <20% de la población total neuronal hipotálamo ventromedial. Agravando este problema es la falta, en muchos casos, de un marcador celular para la identificación de estas neuronas. Por lo tanto, está claro que a pesar de que proporciona valiosa información eléctrica que otras técnicas no pueden, el análisis de patch clamp es laborioso, lento y bajo rendimiento.
El uso de imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas VMH permite el estudio de Hundreds de neuronas simultáneamente. Colorantes sensibles al calcio pueden ser utilizados para medir los cambios de calcio intracelular, lo que indirectamente se correlacionan con los cambios en la actividad neuronal. Potenciales colorantes sensibles de membrana se utilizan para supervisar los cambios potenciales de membrana. La medición de potencial de la membrana celular es un índice más directa de la actividad neuronal en comparación con los cambios en los niveles de calcio intracelulares. Por otra parte, el potencial de formación de imágenes de membrana tinte (MPD) potencialmente detecta pequeños cambios en el potencial de membrana en la potencial de acción disparando no se altera y los niveles intracelulares de calcio podría no cambiar. Ambas técnicas de formación de imágenes de fluorescencia se han utilizado para estudiar VMH neuronas de detección de glucosa a partir de ratones jóvenes 2-7. Si bien los resultados son menos detalladas que las obtenidas con la electrofisiología de pinzamiento zonal, la fuerza de los experimentos de imagen es que evaluar simultáneamente una gran población de células que incluyen inevitablemente un importante número de neuronas de detección de glucosa. MPD imágenes is particularmente útil para el estudio de las neuronas GI que se localizan a lo largo de todo el hipotálamo ventromedial de manera más uniforme; proporcionando así una población adecuada para estudiar en el hipotálamo ventromedial disociado (~ 15% GI). En contraste, mientras que las neuronas de GE están densamente localizado en el ventrolateral-VMN y pobres de células región entre el arco y VMN, que no representan un número significativo de neuronas dentro del hipotálamo ventromedial (<1% GE). Por otra parte, mediante el estudio de las neuronas aisladas, astrocítica y efectos presinápticos son eliminados. Esto puede ser una ventaja en el estudio de efectos de primer orden de las neuronas, así como una desventaja ya que se pierden las conexiones y procesos fisiológicos.
Un factor limitante en tanto patch clamp electrofisiología y la imagen de colorante MPD / calcio es la necesidad de utilizar animales jóvenes (por ejemplo, ratones o ratas. <8 semanas de edad). Esto se produce principalmente debido al aumento de tejido conectivo en combinación con la disminución de la viabilidad neuronal que se produce con la edad. En el cerebro-slice espárrago electrofisiologíaIES, el aumento de tejido conectivo hace que sea más difícil de visualizar las neuronas. El aumento de tejido conectivo también hace más difícil disociar un gran número de neuronas sanas para los estudios de imagen. Además, las neuronas de los animales más jóvenes sobreviven más tiempo durante la grabación de patch clamp o imágenes. Sin embargo, el uso de ratones jóvenes puede ser una limitación importante. Actividad y / o respuestas a neurotransmisores o nutrientes que circulan neuronal cambian con la edad. Por ejemplo, dado que el balance de energía está estrechamente ligada a la situación reproductiva, las neuronas del hipotálamo que regulan el equilibrio energético pueden responder de manera diferente en la pre-vs animales postpubescent. Además, muchas enfermedades requieren tratamiento a largo plazo o no se manifiestan hasta la edad adulta. Los principales ejemplos de tales enfermedades son obesidad dietética o diabetes mellitus tipo 2. Dado que las neuronas de detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en estas enfermedades hemos desarrollado una metodología para el cultivo con éxito neuronas adultas del VMH saludables para su uso en formación de imágenes de exp MPDeriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referências
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- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
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