Abordagens para testar os efeitos de drogas antipsicóticas (APDs) em Caenorhabditis elegans são demonstrados. Os ensaios estão descritos para testar efeitos de drogas sobre o desenvolvimento ea viabilidade e sobre a taxa de bombeamento da faringe. Estes métodos também são aplicáveis para as experiências de farmacogenética com outras classes de drogas que APD.
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Artigo de método
Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em
Neste artigo
Resumo
Resumo
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de grande escala para a frente e reverter telas genéticos e telas genéticos químicos. O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica. Exposição APD produz atraso e / ou letalidade em nemátodos desenvolvimento de uma forma dependente da concentração. Estes fenótipos são causados, em parte, pela inibição induzida por TPA de bombeamento da faringe 1,2. Assim, o fenótipo de desenvolvimento tem uma base neuromuscular, tornando-o útil para estes estudos de neurolépticos. Aqui demonstramos procedimentos detalhados para testar efeitos APD sobre o desenvolvimento do nematóide e da faringe de bombeamento. Para o ensaio de desenvolvimento, os embriões são sincronizados colocado em meio de crescimento de nemátodos placas (NGM) contendo APD, e as fases de desenvolvimento de animals são, então, marcou diária. Para o ensaio de taxa de bombeamento da faringe, encenado animais adultos jovens são testados em placas NGM contendo APDs. O número de bombas da faringe por unidade de tempo é gravado, ea taxa de bombeamento é calculado. Estes ensaios podem ser utilizados para estudar muitos outros tipos de moléculas pequenas ou até mesmo moléculas grandes.
Introdução
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de telas genéticos frente e verso em grande escala e telas genéticos químicos. C. elegans é sensível a um amplo espectro de compostos bioactivos e, por conseguinte, tem sido usado com sucesso para definir os mecanismos de acção de uma variedade de tais compostos. Por exemplo, os compostos bioactivos estudada usando farmacogenética vermes incluem agonistas de receptor de acetilcolina (por exemplo, levamisole, nicotina, morantel, pirantel e), anestésicos (p.ex. halotano), cafeína, os inibidores da colinesterase (por exemplo, aldicarbe, Lannate, e TRICLORFOM), f....
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Protocolo
1. Developmental Delay / Letalidade Ensaio: The Wild-Type (N2) e Dois Mutant (Mut1 e Mut2) Cepas são testadas em três concentrações de clozapina em 12 poços da placa
- No dia 1, 2 ml de derramar NGM médio de 10 em cada cavidade de uma placa de 12 poços (cada poço com um diâmetro de 2 cm) e deixa-se endurecer sobre o banco, à temperatura ambiente (RT) durante a noite. No mesmo dia, escolher uma colônia de bactérias Escherichia coli OP50, infectar uma garrafa de 50 ml de solução de LB e cultura-lo em um shaker 37 ° C a 220 rpm de rotação durante a noite.
- No dia 2, transferir 20 ul de cultura bacteriana OP50 para ....
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Resultados
1. Atraso no desenvolvimento / resultado do ensaio de letalidade
Um resultado típico para o ensaio de atraso / letalidade no desenvolvimento, é demonstrada nas Figuras 1a e 1b. Quando os animais do tipo selvagem no grupo de controle têm crescido para a fase adulta gravídico (Figura 1a), do tipo selvagem animais expostos à clozapina ainda estão nos estágios larvais jovens ou estão mortos (Figura 1b). Figura 1c mostra um resultad.......
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Discussão
Aqui, descrevemos métodos para testar os efeitos de APDs sobre o desenvolvimento e comportamento de C. elegans. DMSO ou o etanol é usado para dissolver a clozapina, uma vez que o fármaco é relativamente insolúvel em água. Porque os solventes foram relatados para afectar C. elegans biologia 12, grupos de controle de etanol-alone DMSO-alone ou são essenciais. A concentração mais elevada de DMSO utilizada nos ensaios é superior a 3%, o que não tem um efeito óbvio sobre C. elegans desen.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há conflito de interesse envolvidos.
Agradecimentos
O trabalho foi financiado pelo NIH um prêmio Desenvolvimento Scientist Clínica K08NS002083, um Grant Instituto de Pesquisa Shervert Frazier, e uma Investigator Award NARSAD Young para Edgar A. Buttner.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Clozapina | Sigma | C6305 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Ácido acético (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| Hidróxido de sódio (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| Hipoclorito | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Centrífuga 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| Agitador de incubadora | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| Incubadora de baixa temperatura 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX12 | |
| Placa de Petri 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12 poços Placa de cultura de tecidos | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al.
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Reimpressões e permissões
