의 체계적인 분석<em> 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여> 셀 롤링
Summary
이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.
Abstract
세포 기반 치료를위한 주요 과제는 전신 정맥 내 또는 동맥 내 주입 다음 그 조직에 고효율로 생존 세포의 대량을 대상으로 할 수 없다는 것이다. 따라서, 휴대폰 호밍을 증가하는 것은 현재 세포 치료를 개선하기위한 전략으로 연구된다. 혈관 내피 세포에 압은 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계이며 평행 평판 유동 챔버 (PPFC)를 이용하여 시험관 프로빙 할 수있다. 그러나,이 저조한 제어 흐름 조건, 매우 지루한, 낮은 처리량 분석이다. 대신, 우리는 정밀하게 제어, 생리학 관련 전단 흐름 1,2에서 높은 처리량 세포 롤링 특성의 연구를 가능하게하는 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 이 논문에서, 우리는 P-및 E-셀렉틴 코팅 표면뿐만 아니라 세포 단층 코팅 표면에 HL-60 (인간 골수성 백혈병) 세포의 회전 특성이 readil 할 수있는 방법을 보여y를 조사했다. 더 염증성 조건을 시뮬레이트하도록, 미세 유체 채널 표면이어서 상당히 동적 조건하에 HL-60 세포와의 상호 작용을 증가 종양 괴사 인자-α (TNF-α)로 활성화 된 내피 세포 (EC에)으로 코팅 하였다. 향상된 처리량과 같은 속도를 압연과 경로를 압연과 같은 매개 변수의 신속한 분석을 허용 통합 된 다중 매개 변수 소프트웨어 분석 플랫폼은 체외 세포 롤링 특성을 평가하기위한 중요한 장점이다. 세포 압연 및 원점 복귀에 영향을 미칠 수 있도록 설계 엔지니어링 방식의 신속하고 정확한 분석을 허용,이 플랫폼은 사전 외인성 세포 기반 치료를하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
세포 기반 치료의 성공적인 임상 번역의 주요 과제 중 하나는 비효율적 인 배달 또는 원하는 사이트 3,4에 체계적으로 주입 된 세포를 대상으로합니다. 따라서, 휴대폰 호밍을 개선하기위한 방법 일정한 검색이있어, 특히 세포 치료를 개선하기위한 전략으로, 압연 전지. 혈관에 롤링 세포는 고전적인 질병 사이트 5 모집 백혈구에 대해 정의 된 세포 유도 폭포,에서 중요한 단계입니다. 이 단계는 내피 셀렉틴 사이 특정 상호 작용에 의해 지배된다, 즉, P-및 E-셀렉틴 (P-및 E-SEL), 백혈구 5,6의 표면에 자신의 카운터 리간드. 더 나은 이해와 셀 원점 복귀의 효율 향상, 특히 압연 단계는 세포 기반 치료를 개선하기 위해 새로운 플랫폼에 대한 탐구에 매우 중요합니다. 지금까지이 두 평면 플랫폼을 포함, 평행 판의 흐름 챔버 (PPFCs)를 사용하여 달성되었다세포 현탁액을 주사기 7,8, 9 펌프 사용하여 관류 통해 상부 플레이트에있는 유입과 유출 포트와 그들 사이 가스켓와 에스. 바닥 판의 표면은 중요한 세포 단층 / 기질로 코팅 될 수 있고, 전단 유동하 관류 세포와 표면 사이의 상호 작용은 다음 7을 탐구이다. 그러나 PPFC 거품 형성, 누출, 주요 단점을 제시 제대로 제어 흐름과 낮은 처리량, 시약 소모 및 매우 지루한 방법입니다.
전통적인 PPFC에 대한 대안 기술은 낮은 시약 소비 1,10으로, 정확하고, 컴퓨터로 제어되는 전단 흐름에서 세포 분석의 높은 처리 성능 (PPFCs보다 최대 10 배 이상)을 허용, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템입니다. 셀 롤링 실험은 USI를 세포 단일 층 또는 설계 기판 코팅 및 이미지가 될 수는 미세 유체 채널 내에서 수행된다NG 롤링 특성을 가진 현미경은 쉽게 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 이 연구에서, 우리는 인간 골수성 백혈병 다른 표면에 (HL-60) 세포의 회전 특성을 연구하여이 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 보여줍니다. HL-60은 P-및 E-SEL뿐만 아니라 다른 롤링 수용체를 발현하는 세포의 단층을 분석 하였다 같은 기판 상에 롤링. 또한, 항체 (AB)에 그 표면에 HL-60의 회전 운동을 중재의 특정 셀렉틴의 직접 참여를 설명하는 데 사용되었다 블로킹. 롤링 실험은 같은 회전 속도, 회전 세포 수 및 압연 경로 속성으로 키 롤링 매개 변수의 효율적인 분석을 허용하는, 최소한의 시약 / 셀 소비, 안정적인 전단 흐름에 따라, 용량 증가 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
외인성 세포 기반 치료의 성공적인 번역의 주요 과제 중 하나는 효율적으로 높은 생착 효율 3 부상과 염증의 사이트에 세포를 제공 할 수 없다는 것입니다. 셀룰라 롤링 결국 조직 (5)에 내피 통해 확고한 부착 및 이주에 이르는, 혈관의 벽에 세포의 감속을 용이 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계를 나타낸다. 후보 세포 유형에 대한 압연 공정의 더 나은 이해는 세포 호밍을 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CHO-P 세포 박사 바바라 Furie (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의과 대학)에서 일종의 선물이었다. 이 작품은 JMK에이 작품은 또한 JMK에 Movember – 전립선 암 재단 챌린지 상에 의해 부분적으로 지원되었다 건강 보조금 HL095722의 국립 연구소에 의해 지원되었다
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
Referências
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