Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio's van de Adult knaagdierhersenen

Summary

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Abstract

Recent onderzoek toont aan dat het centrale zenuwstelsel (CNS) regeneratie en het ontstaan ​​van tumoren gaat populaties van stamcellen (SC) ingezetene in de volwassen hersenen. Echter, de mechanismen die normaal rustende cellen gebruiken om de goede werking van neurale netwerken, alsook hun rol in het herstel van de schade en de beperking van neurodegeneratieve processen te waarborgen zijn weinig begrepen. Deze cellen verblijven aangeduid als "niches" dat een onderhoudende milieu door modulerende signalen van zowel de vasculaire en immuun systemen regio. De isolatie, onderhoud, en differentiatie van CNS SCs onder gedefinieerde kweekomstandigheden die onbekende factoren uit te sluiten, maakt ze toegankelijk zijn voor behandeling met farmacologische of genetische middelen, en geven zicht op hun in vivo gedrag. Hier bieden we gedetailleerde informatie over de methoden voor het genereren van culturen van CNS SC's uit verschillende regio's van de volwassen hersenen en benaderingen om hun d beoordelenifferentiation potentieel tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten in vitro. Deze techniek levert een homogene celpopulatie een monolaag cultuur die kunnen worden gevisualiseerd individuele SC en hun nageslacht bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast in verschillende diermodellen en klinische monsters, die eerder werden gebruikt voor regeneratieve reacties in de beschadigde volwassen zenuwstelsel voorspellen.

Introduction

Het centrale dogma van neurobiologie, door de fundamentele opmerkingen van de hersenen cytoarchitecture gemaakt door Ramón Y. Cajal meer dan een eeuw geleden gelegd, geoordeeld dat neurogenese onwaarschijnlijk was na de adolescentie gezien de complexiteit van de neurale netwerken in het CZS ^1. Hoewel de werkzaamheden van Altman in de jaren 1960 en later Kaplan, waaruit blijkt dat ^3H-thymidine kunnen worden gevonden in volwassen neuronen aangeeft dat daadwerkelijk neuronen werden geproduceerd in verschillende gebieden van de volwassen hersenen, het dogma bleef houden ^{2, 3.} Bewijs bleef te monteren met Nottebohm onderzoek beschrijft de seizoensgebonden veranderingen in het aantal neuronen aanwezig in zangvogel hersenen ^4. Het was niet tot 1999, toen Gould et al.. Gepubliceerde werk op de generatie van neuronen in de hippocampus neemt toe met de prestaties van associatieve leertaken in rat, evenals de opmerkingen van Kornack en Rakic ​​demonstratieting verder neurogenese in de volwassen makaak dat het begrip minder stijve, meer kunststof hersenen, werd erkend ^{5, 6.}

De zoektocht naar de cellulaire bron voor deze novo gegenereerde neuronen leiden tot de ontdekking van een discrete populatie van stamcellen (SC) dat in gebieden van de hersenen verblijven genoemd niches ^7. Subventriculaire zone sub korrelige gebied van de hippocampus worden beschouwd als de twee belangrijkste neurogene regio ^8,9 zijn. Cellen geïsoleerd uit deze locaties toont de klassieke kenmerken van embryonale of foetale afgeleide SC, zelfvernieuwing en differentiatie potentieel. Bij neurale stamcellen (NSC's), kunnen ze worden gedifferentieerd tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Bovendien, deze SC vlek positief voor foetale NSC merkers zoals het intermediaire filament eiwit nestine ^10. Meer recent werk benadrukt dat SC's niet kan worden beperkt tot deze two gebieden, en in feite gelokaliseerd door de hersenen als een grotendeels rustende populatie cellen stevig verbonden aan het vaatstelsel ^11.

De opmerkingen die SCS gemobiliseerd in reactie op letsel suggereert de mogelijkheid van het kunnen deze cellen te gebruiken voor regeneratieve doeleinden om te helpen bij het ​​herstel van neurodegeneratieve ziekte en beroerte ^{12, 13.} Dit is niet anders dan de rol die mesenchymale stamcellen (MSC's) spelen bij de genezing van bindweefsel, die worden aangetroffen als perivasculaire cellen die het potentieel om osteoblasten, chondrocyten en vetcellen ¹⁴ geworden. Echter, NSCs niet op dezelfde wijze als MSCs geoogst uit beenmerg door routine aspiratie en dichtheidsgradiënt centrifugatie technieken en vervolgens gebruikt in autologe cellen gebaseerde therapieën. Bijgevolg andere bronnen van cellen, zoals het gebruik van foetale NSCs of neuronale precursors afgeleid van embryonic stamcellen zijn uitgebreid onderzocht in dierlijke ziekten en letsel modellen met wisselend succes ^15. Geïnduceerde pluripotente stamcel technologieën gebruik te maken van somatische cellen bronnen bieden een andere potentiële weg voor de productie van therapeutisch bruikbare cel-gebaseerde therapieën voor een breed scala van toepassingen, het overwinnen van de beperkte beschikbaarheid en ethische bezorgdheid over het gebruik van embryonale cellen en foetale weefsels ^16. Klinische vertaling van deze bevindingen blijkt een moeilijke taak, zoals gedemonstreerd in de strijd van de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen met SC-gebaseerde therapeutische benaderingen ^17,18, evenals een kronkelige baan regelgevende goedkeuring. Als alternatieve benadering kan invoering van specifieke farmacologische behandelingen NSC nummers moduleren en herstel van de ziekte van Parkinson en beroerte ¹⁹ vergemakkelijken. Ongeacht de strategie kan worden, begrijpen hoe ze effectief te manipuleren deze cellenvereist een toegankelijk in vitro systeem.

Culturen van NSCs kan worden uitgevoerd als aggregaat culturen, ook bekend als neurosferen, of een monolaag ^8,20. Beide technieken zijn op grote schaal gebruikt, waardoor de vestiging van bepaalde kweekomstandigheden, dwz gebruik van epidermale groeifactor (EGF) of basische fibroblast groeifactor (bFGF) als een mitogeen bron, die voorzien in de uitbreiding van multipotente voorlopers. Terwijl neurosfeerculturen beter geschikt voor het bestuderen van klonale vermeerdering vermogen van een geïsoleerde celtype zijn, is het systeem getoond om een gemengde populatie van cellen tijdens de expansie ^21. Bovendien, de gesloten structuur neurosferen maakt farmacologische manipulatie van de cellen onpraktisch en de interpretatie van deze factoren invloed kunnen hebben kunnen verward worden door de in de neurosphere zich gevestigd micromilieu. Monolaagkweken, anderzijds, kanwerkzaam in high throughput-schermen van kleine molecule bibliotheken, die een krachtig hulpmiddel om de signaaltransductie mechanismen die SC groei en differentiatie regelen en opent de mogelijkheid om nieuwe verbindingen die specifiek deze cel bevolking ontdekken verkennen.

Bijgevolg kan de mogelijkheid om reproduceerbaar genereren kweken van volwassen NSCs uit verschillende gebieden van belang in de hersenen worden gebruikt in een breed spectrum van wetenschappelijke toepassingen, variërend van ontwikkelingsstudies van het centrale zenuwstelsel (CZS) te onderzoeken van nieuwe regeneratieve geneeskunde benaderingen . De hier gepresenteerde protocol laat zien hoe te ontleden en de differentiatie potentieel van CNS SC's geïsoleerd van de volwassen knaagdierhersenen beoordelen.

Protocol

Het werk houdt zich aan de Verklaring van Helsinski en de ARVO Animal Statement. De dieren werden gebruikt voor weefselverzameltoestel en alle relevante werkwijzen werden gevolgd volgens de instructies van de dierfaciliteit bij de Universiteit van Dresden. De dieren werden behandeld en gehuisvest in overeenstemming met de Duitse richtlijnen voor het gebruik en de verzorging van proefdieren, en de studie werd goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden. Neem contact op met het veterinaire beleid van uw instelling (IACUC …

Representative Results

Het identificeren van de regio van belang om uit te neurale stamcellen te oogsten is de belangrijke eerste stap en zal de hoeveelheid tijd die het duurt om een ​​samenvloeiing plaat van cellen krijgen definiëren. Bijvoorbeeld, de SVZ is een klassiek neurogene stippellijn daarom een ​​hogere relatieve verhouding van neurale stamcellen. Echter, de hier gepresenteerde techniek worden gebruikt met andere regio's vaak niet erkend als robuust neurogene mogelijk tijdens de volwassenheid. Voor de toepassing van dit…

Discussion

Veel van de kritische stappen succesvolle isolatie, expansie en differentiatie van neurale stamcellen uit volwassen hersenen worden gedeeld gemeen met standaard weefselkweektechnieken. De doelstelling om in gedachten te houden is dat NSCs geïsoleerd van de volwassen hersenen als veel van hun in vivo eigenschappen mogelijk (Figuur 2J) moet blijven. Vaak een evenwicht tussen noodzakelijke voorzichtigheid en gepaste snelheid moet worden gevonden. Zorg met de isolatie van de hersenen uit de schede…

Materials

6-well tissue culture dishes	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C).
Fibronectin	R&D Systems	1030-Fn	Do not agitate stock solution
Filtration Apparatus	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	See note below for complete N2 media preparation
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months)
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S-5261	500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months)
Progesterone	Sigma-Aldrich	P-8783	100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months)
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R&D Systems	233-FB	Working concentration 20 ng/ml
Delta4 (Dll4)	R&D Systems	1389-D4	Working concentration  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R&D Systems	623-AN	Working concentration  500 ng/ml
JAK Inhibitor	Calbiochem	420099	Working concentration 200 nM
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-2058
15- and 50-ml Conical tubes	Corning Life Sciences	430053, 430829
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.  Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light.
			[header]
				Immunofluorescence Reagents Table
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15719
Normal Donkey Serum (NDS)	Sigma-Aldrich	D-9663
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8787
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D-8417	5 mg/ml stock solution in methanol
			[header]
			Primary Antibody Table
Nestin	Chemicon	MAB353	Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG
Sox2	R&D Systems	MAB2018	Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R&D Systems	MAB1195	Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)	Dako North America	Z0334	Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit
			[header]
			Secondary Antibody Table
Alexa   568	Invitrogen	A-21124	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit