Sistema de co-cultura com uma fatia organotípicas Cérebro e esferóide 3D de carcinomas de células

Summary

A co-cultura de fatia cerebral organotípicas com células de carcinoma permite visualizar as alterações morfológicas por fluorescência, bem como o campo brilhante (vídeo) microscopia durante o processo de invasão de células de carcinoma de tecido cerebral. Este modelo de sistema também permite abordagens taxas de célula e de reabastecimento e oferece uma ampla variedade de manipulações e análises.

Abstract

Os pacientes com metástase cerebral de carcinomas têm um prognóstico pobre. No entanto, o processo no local metastático tem sido pouco investigada, em particular, o papel das células estromais (residente). Estudos em carcinomas primários demonstrar a influência do microambiente em metástase, mesmo no prognóstico ^1,2. Especialmente os macrófagos associados ao tumor (TAM) migração apoio, invasão e proliferação ^3. Curiosamente, os principais locais alvo de metástase possuem macrófagos de tecidos específicos, tais como células de Kupffer do fígado ou da microglia no sistema nervoso central. Além disso, os locais metastáticos também possuem outras células de tecidos específicos, tais como os astrócitos. Recentemente, os astrócitos foram demonstradas para promover a proliferação e persistência de células de câncer ^4,5. Portanto, as funções destes tipos de células específicas de tecidos parece ser muito importante no processo de metástase cerebral ^6,7.

Apesar dessas observações,no entanto, até agora não há adequado modelo in vivo / in vitro disponíveis para visualizar diretamente as reações gliais durante a formação de metástase cerebral, em particular por meio de microscopia de campo claro. Recentes in vivo de imagens ao vivo de células de carcinoma demonstrou seu comportamento colonização cerebral ^8. No entanto, este método é muito trabalhoso, dispendioso e tecnicamente complexa. Além disso, estes tipos de experimentos com animais são restritos a pequenas séries e vêm com um esforço substancial para os animais (pela implantação da placa de vidro, a injeção de células tumorais, a anestesia repetitiva e fixação de longa duração). Além disso, a imagem in vivo é, portanto, muito limitado para a visualização de células de carcinoma, ao passo que as interacções com células residentes ainda não foram ilustradas. Finalmente, as investigações de células de carcinoma humanos dentro animais imunocompetentes são impossíveis ^8.

Por estas razões, foi estabelecido um sistema de co-cultura consipicada de uma fatia de cérebro do rato organotípica e células epiteliais embutido em matrigel (esfera celular 3D). As esferas de carcinoma de células em 3D foram colocados ao lado da borda fatia do cérebro, a fim de investigar a invasão do tecido cerebral vizinho. Isso nos permite visualizar as alterações morfológicas e interações entre as células da glia e células de carcinoma de fluorescência e até mesmo por microscopia de campo claro. Após a experiência de co-cultura, o tecido cerebral, ou os esferóides de células em 3D podem ser recolhidos e utilizados para outras análises moleculares (por exemplo, de qRT-PCR, IHC, ou immunoblot), bem como para investigações através de microscopia confocal. Este método pode ser aplicado para monitorizar os eventos dentro de um tecido cerebral vivo para dias sem efeitos deletérios para as fatias do cérebro. O modelo também permite uma supressão selectiva e substituição das células residentes por células de um tecido dador para determinar o impacto distinto de um dado genótipo. Finalmente, o modelo de co-cultura é uma alternativa viávelpara in vivo se aproxima ao testar manipulações farmacológicas alvejados.

Protocol

Este novo modelo é uma adaptação de uma abordagem fatia do cérebro do hipocampo organotípica publicado anteriormente ^9-12. As modificações e adições foram introduzidas para otimizar as interações de tecido de câncer de células do cérebro e para garantir a reprodutibilidade. O estudo foi analisado e aprovado pelo comitê de ética local. Os animais foram tratados com cuidado de acordo com as diretrizes para cuidados com os animais na Medicina da Universidade de Göttingen. A co-cultura organotípicas fatia do cérebro pode ser subdividida em duas etapas. O primeiro passo é a preparação da fatia do cérebro organotípica. Passo dois compreende a preparação de células de tumor e de deposição no modelo de co-cultura.

1. Organotípicas Cérebro Slice

1. Preparar o meio de dissecção consistindo em meio essencial mínimo (MEM), suplementado com 0,2 mM de glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, e 4,5 mg / ml de glicose.
2. Decapitar os ratos a partir de toda a tensão do mouse entre o dia pós-natalseis e oito (P6-8).
3. Remover o cérebro rapidamente do crânio, sob condições assépticas, e transferi-lo para o meio de dissecção gelado.
4. Remover o pólo frontal e o cerebelo a partir da secção de todo o cérebro.
5. Fix e estabilizar o cérebro em um palco com cola crio e 5% de agarose.
6. Corte as secções cerebrais horizontalmente para uma espessura de 350 um, utilizando um vibratome.
7. Recolhe 4-6 inteiros fatias de cérebro de um único cérebro do rato, dependendo da espécie e idade.
8. Preparar o meio de cultura consistindo de 50% de MEM, solução de sal equilibrado de 25% de Hanks (HBSS), 25% de soro normal de cavalo (NHS), 0,2 mM de glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina (Sigma, Munique, Alemanha), e glucose 4,5 mg / mL.
9. Coloque cada fatia de cérebro organotípica num mM policarbonato transwell insert membrana 0.4 numa placa de seis poços com 1 ml de meio de cultura no poço inferior.
10. Cultura organotípicas fatias do cérebro durante a noite em um humidified atmosfera com 5% de CO _2, a 37 ° C incubadora.

2. O Modelo Slice Coculture

1. Encaixe 10 ⁵ de tumor transfectadas com GFP ou outras células (por exemplo, células MCF-7-GFP) em 20 mL de matriz de gel, consistindo em 15% de meio RPMI e 85% de gel de ECM.
2. Coloque a mistura de matriz de células MCF-7-gel em um espaçador metálico estéril (3,8 mm de diâmetro) directamente adjacente à região cortical do cérebro fatia organotípicas e incubar durante 2 horas.
3. Remover o espaçador e permitir o esferóide tumor 3D para co-cultura com a fatia organotípicas de 24-96 horas.
4. Altere o meio de cultura a cada dois dias.

3. Imunofluorescência Coloração de astrócitos e microglia no organotípicas cerebral Fatia Coculture

1. Fixe a co-cultura organotípicas fatia do cérebro com paraformaldeído a 4% para 8 horas a 4 ° C.
2. Lava-se a co-cultura de fatia com PBST (PBS com 0,5% de Triton X-100) durante 5 min.
3. Bloquear as splos com soro normal de cabra em PBST (01:20) à temperatura ambiente durante 1 hora.
4. Manchar os astrócitos incubando a co-cultura de fatia de cérebro com fibrilar glial anti-anticorpo monoclonal de proteína ácida (GFAP, 1:200 em PBST) durante 36 horas a 4 ° C seguido por anticorpo de cabra anti-murganho-TRITC (1:100 em PBST) coloração durante 1 hora à temperatura ambiente.
5. Lavar as amostras com PBST três vezes, durante 5 min.
6. Corar as células microgliais com ILB _4-Alexa Fluor 647 (1:100 em PBST) durante 1 hora à temperatura ambiente.
7. Contracoloração cérebro fatia de co-cultura com DAPI (1:1000) durante 3 minutos à temperatura ambiente.
8. Monte e lamela cérebro fatia co-cultura com DAKO fluorescente meio de montagem.
9. Avaliar o grau de invasão do tumor com base no seguinte sistema de pontuação: 0 = nenhuma das células; + <1/3; + + = 1/3 - 2/3; + + + ≥ 2/3 das células invadidas (primeiro medir o comprimento da seção de contato entre o plugue tumor e fatia, em seguida medir o fraccionamenton de contacto detectável pelas células invasoras).

4. Imagens ao vivo da interação entre a glia e células tumorais

1. Realize o experimento em uma Leica invertido DMI 6000B microscópio 10X lente de ampliação e uma Leica DFC câmera CCD 350 FX.

Results

Em primeiro lugar, todas as células de carcinoma utilizados (humano: MCF-7 e murino: 410.4) invadiram a fatia do cérebro organotípica mouse. A invasão foi, por conseguinte, da espécie independentes (Figura 1A), que indica que uma vasta gama de aplicações de uma forma independente de espécies. Além disso, a microglia, bem como astrócitos acumuladas na interface conforme anteriormente descrito, in vivo e em amostras de paciente ^13. Imaging Time-lapse durante um período prolongado de tempo, não só revelou a viabilidade da fatia, mas também ofereceu uma boa plataforma para observar as interações celulares. Através de experiências de lapso de tempo, as células microgliais foram gravadas para entrar no 3D esfera celular enquanto, por sua vez, as células cancerosas também invadiu a fatia do cérebro (Figuras 1B1-B2). Além disso, mostrámos previamente a capacidade de microglia para transportar células de carcinoma por um mecanismo ainda enigmática, assim, ajudar na invasão carcinoma. Usando técnicas de imunofluorescência, nósdescrito co-localizações de células tumorais e de células do estroma (por exemplo, microglia e astrócitos), tanto no tecido cerebral e no bujão de células de tumor (Figuras 1C-D), o que sugere uma interacção estreita entre estas células, durante o processo de invasão. Foram obtidos resultados comparáveis ​​quando fatias do cérebro do rato foram co-cultivados quer com humanos (Figuras 1C1-C3) ou murino (Figuras 1D1-D3) de células de carcinoma - que mostra a grande gama de aplicações para o estudo de células de diferentes espécies, e estirpes de genótipos.

Figura 1. Cérebro modelo de co-cultura fatia com um esferóide 3D ​​de rato e células de carcinoma humanos. A) Quantificação da invasão de células de câncer em todo organotípicas coculturas fatia do cérebro com um rato de câncer de mamalinha celular de 410,4 ou uma linha celular de cancro da mama humano MCF-7. Os dados representam a percentagem de o grau de invasão de células na fatia de cérebro em cada grupo com n ≥ 38. Não houve diferença significativa entre os dois grupos (teste de Kruskal-Wallis). B) imagens de lapso de tempo de todo organotípicas coculturas fatia do cérebro com células MCF-7-GFP e imagens representativas de dia2 (B1) e dia 5 (B2) foram mostrado. imagens de microscopia CD) confocal mostrou coortes de carcinomas, astrócitos e microglia. Coloração dupla de astrócitos (anti-GFAP-TRITC, vermelho) e microglia (ILB4-Alexa Fluor 647, violeta) de toda a co-cultura com a grossa fatia organotípicas cérebro 350 mM ea ficha de células tumorais transfectadas-GFP (verde): 3D- MCF-7-GFP (C1-C3) e 3D-410.4-GFP (D1-D3). Traços brancos mostraram a borda da fatia de cérebro e da frente da invasão tumoral. As barras de escala representam 50 mm. Microglia, astrócitos umª tumores colocalizations (C1 e D1), astrócitos-tumores colocalizations (C2 e D2) e colocalizations microglia-tumorais (C3 e D3) na co-cultura fatia. Clique aqui para ver a imagem ampliada

Discussion

Investigações histológicas anteriores de metástase cerebral demonstrou mudanças rápidas e drásticas das células gliais residentes, especialmente de astrócitos e microglia ^13. Para estudar essas mudanças e interações com as células de carcinoma, este sistema de co-cultura romance é bem adequado. Outros campos de pesquisa já tem experiência de longa data com organotípicas fatias do cérebro do hipocampo. Uma vantagem é que as culturas organotípicas do hipocampo do cérebro de fatia são viáveis ​​e eficazmente conservados durante dias ou semanas, tornando-o adequado para as experiências de longo prazo. Desde a introdução de Stoppini do sistema de fatia de hipocampo organotípicas em 1991, tem sido amplamente utilizada, por exemplo, na pesquisa de doenças degenerativas. Assim, este sistema de co-cultura de inovar representa uma modificação de um método bem estabelecido com uma variedade de aplicações em biologia tumoral ^9,11. A modificação nos ofereceu um modelo reproduzível para avaliar o grau de invasão tumoral afterwards e culturas cultivadas pelo método de interface são idealmente adequado para experiências que requerem uma estrutura tridimensional. Várias técnicas têm sido utilizadas para co-cultura de fatias de hipocampo organotípicas com outras células. Estes incluem um sistema indirecto entre as células de macrófagos e a fatia de cérebro organotípica ^14, e um co-cultura directa de duas fatias diferentes da região do hipocampo ^15. Agregados glioma também foram co-cultivadas com fatias de cérebro ^16. Estes modelos podem ser utilizados para analisar eventos celulares e moleculares nas fatias do cérebro, mas não permitem o contato direto, fisiológica entre as células tumorais, microglia e parênquima cerebral. Além disso, este método permite a observação da microglia, sem contaminação de osso derivadas de medula periféricas monócitos / macrófagos. A utilização do modelo de ratinho transgénico CCR2 e CX3CR1 é uma melhoria fundamental devido ao facto de que é difícil de distinguir da microglia residentes invadam monócitoscom base em suas propriedades semelhantes ^17,18,19. Embora a injecção intracerebral de células de carcinoma permite investigar a progressão do tumor, não se pode dizer tanto quanto a saber se as células semelhantes a macrófagos rodeadas originam a população residente microglia do cérebro ou da medula óssea derivadas de monócitos / macrófagos periféricos ^17. A equipe de Kettenmann introduziu um modelo fatia do cérebro organotípica que envolveu a inoculação de células de glioma em fatias de cérebro com um micromanipulador ^20. No entanto, gliomas malignos primários diferem em muitos aspectos de carcinomas metastáticos. Primeiro, gliomas malignos são de origem mesenquimal, não metástase fora do sistema nervoso, e migrar / invadir células individuais como sem fronteira entre tumor e tecido cerebral. Por outro lado, o crescimento infiltrativa é uma característica típica patológico, e tais carcinomas geralmente migram / invadir como coortes. Em segundo lugar, os carcinomas frequentemente tentam reconstruir estruturas epiteliais no cérebro, ao passo que as células gliaistente separar o tumor a partir do tecido do cérebro por um (pseudo) da cápsula. Considerando-se características biológicas e morfológicas, glioma maligno e metástase dos carcinomas não são realmente comparáveis. Por estas razões, é modificado e desenvolvemos um sistema de co-cultura em que não co-cultura de injectar mas um tampão de células de carcinoma adjacente à fatia cerebral. Além disso, observou-se acumulação de microglia e astrócitos, na fronteira do bujão do tumor, o que significa que a microglia inserir a ficha do tumor e pode ser facilmente detectada por microscopia de campo brilhante e confirmados posteriormente por meio de microscopia confocal. As células cancerosas invadir na fatia do cérebro, que é comparável à do real em situação vivo e uma observação feita por Baumert e seus colegas, que encontraram uma zona de infiltração em 63% dos casos de autópsia com metástases cerebrais ^21.

Por causa da falta de perfusão de sangue, existem apenas residente macrófagos / microglia nesta cultura. Além disso, por causa da mcélulas Issing T e, portanto, ausentes alo-reactividade, as células de carcinoma humano pode ser utilizado para a co-cultura, mesmo com fatias de cérebro de ratos imunocompetentes como em ratos (NMRI, B6, ou Wistar). Tal pode servir como uma alternativa para o modelo do ratinho nu. Desde 4-5 fatias pode ser obtido a partir de cada ratinho, são necessários números significativamente reduzidos de animais, em comparação com os modelos de injecção existentes. Além disso, os animais não sofrem durante um longo período de doença metastática e não submetidos a procedimentos operatórios repetitivamente ^22.

Com este sistema de co-cultura, que demonstraram a activação da microglia por células cancerosas e a capacidade de promover a invasão de células de cancro. Além disso, esta é a primeira vez, para o nosso conhecimento, microglia foram encontrados para transportar activamente células de carcinoma ^23.

Apesar de todas estas vantagens, o sistema de co-cultura tem, de fato, também limitações. É ainda um in vitromodelar faltando os passos de metástase antes da colonização. Por causa da falta de perfusão, não é possível estudar o extravasamento. Assim, o caminho alternativo para estudar o extravasamento é usar o modelo in vivo de injecção ou o sistema de câmara de Boyden modificada com a matriz extracelular, as HUVEC e astrócitos para imitar a barreira sangue-cérebro ^22,24. O método de co-cultura fatia do cérebro é ainda um modelo confiável e reprodutível com muitas vantagens e um potencial para uma grande variedade de aplicações, tais como a análise da colonização, em particular, com um foco sobre o papel das células residentes. A combinação com outras técnicas estabelecidas (como a imuno-histoquímica, microscopia confocal e microscopia de lapso de tempo) apoia a investigação de interações diretas célula-célula. É uma alternativa e complementação de outras técnicas fáceis e oferece acesso à investigação das pistas e efeitos como impostas pelo microambiente metastático.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' s solução salina balanceada (HBSS)	Gibco, Darmstadt,Alemanha	24020
Meio essencial mínimo (MEM)	Gibco, Darmstadt, Alemanha	32360
RPMI-1640	PAA Laboratories Inc., Cö lbe, Alemanha	E15-840
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha	P04-36500
Soro normal de cavalo (NHS)	Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	16050-122
Soro fetal de bezerro (FCS)	Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	10091148
Glicose	B. Braum, Melsungen, Alemanha
Solução de L-glutamina-penicilina-estreptomicina	Sigma, Steinheim, Alemanha	G1146
Vibratome	Leica, Wetzlar, Alemanha	Leica VT1200S
Microtome	Leica, Wetzlar, Alemanha	Leica SM 2000R
Membrana de policarbonato	BD Falcon, Heidelberg, Alemanha	353090	inserção de membrana transwell (0,4 μ m tamanho do poro)
gel ECM	Trevigen, R & D, Wiesbaden-Nordenstadt, Alemanha	3432-005-01	Extrato de membrana basal
Espaçador metálico	Kig GmbG, Kirkel, Alemanha	DIN 433
Microscópio confocal	Zeiss, Gö ttingen, Alemanha	LSM 510
Microscópio e câmera de lapso de tempo	Leica, Wetzlar, Alemanha	Microscópio DMI 6000B e uma câmera CCD DFC 350 FX Microscópio de
	ttingen, Alemanha	Stemi SV11
Paraformaldeído	Merck, Darmstadt, Alemanha	1.04005.1000
Anticorpo monoclonal de camundongo anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP)	Sigma, Steinheim, Alemanha	G3893
IgG anti-camundongo de cabra, F(ab')2- TRITC	Santa Cruz, Heidelberg, Alemanha	SC3796
Isolectina GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugado	Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha	132450
DAPI (4',6'-diamidino-2-fenilindol dihifrocloreto)	Sigma, Steinheim, Alemanha	D8417
Meio de montagem fluorescente	DAKO, Glostrup, Dinamarca	S3023