कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ organotypic मस्तिष्क टुकड़ा coculture मस्तिष्क के ऊतकों की कार्सिनोमा सेल आक्रमण की प्रक्रिया के दौरान प्रतिदीप्ति के साथ ही उज्ज्वल क्षेत्र (वीडियो) माइक्रोस्कोपी द्वारा morphological परिवर्तन दृश्यमान करने में सक्षम बनाता है. इस मॉडल प्रणाली भी सेल विनिमय और आपूर्ति के दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है और जोड़तोड़ और विश्लेषण की एक विस्तृत विविधता प्रदान करता है.
कार्सिनोमा के मस्तिष्क मेटास्टेसिस के साथ मरीजों को एक गरीब पूर्वानुमान है. हालांकि, metastatic साइट पर प्रक्रिया मुश्किल से विशेष रूप से, निवासी (stromal सेल) की भूमिका की जांच की जा चुकी है. प्राथमिक कार्सिनोमा में अध्ययन भी रोग का निदान 1,2 पर, मेटास्टेसिस पर microenvironment के प्रभाव का प्रदर्शन. विशेष रूप से ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) का समर्थन प्रवास, आक्रमण और प्रसार 3. दिलचस्प है, मेटास्टेसिस का प्रमुख लक्ष्य साइटों ऐसे सीएनएस में जिगर या microglia में Kupffer कोशिकाओं के रूप में ऊतक विशेष मैक्रोफेज, अधिकारी. इसके अलावा, metastatic साइटों को भी astrocytes की तरह अन्य ऊतक विशेष कोशिकाओं, अधिकारी. हाल ही में, astrocytes प्रसार और कैंसर कोशिकाओं 4,5 के हठ को बढ़ावा के लिए प्रदर्शन किया गया. इसलिए, इन ऊतक विशेष प्रकार की कोशिकाओं के कार्यों मस्तिष्क मेटास्टेसिस 6,7 की प्रक्रिया में बहुत महत्वपूर्ण होने लगते हैं.
इन टिप्पणियों के बावजूद,हालांकि, अब तक सीधे उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेष रूप से मस्तिष्क मेटास्टेसिस गठन के दौरान glial प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए उपलब्ध विवो / इन विट्रो मॉडल में कोई उपयुक्त है. कार्सिनोमा कोशिकाओं के vivo रहते इमेजिंग में हाल के उनके मस्तिष्क बसाना व्यवहार 8 का प्रदर्शन किया. हालांकि, इस पद्धति बहुत, श्रमसाध्य महंगा है और तकनीकी रूप से जटिल है. इसके अलावा, पशु प्रयोगों के इन प्रकार के छोटे श्रृंखला के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं और एक बड़ा (ग्लास प्लेट के आरोपण से, ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन, दोहराव संज्ञाहरण और लंबी अवधि के निर्धारण) जानवरों के लिए तनाव के साथ आते हैं. निवासी कोशिकाओं के साथ बातचीत अभी तक सचित्र नहीं किया गया है, जबकि इसके अलावा, vivo इमेजिंग में इस प्रकार अब तक, कार्सिनोमा कोशिकाओं के दृश्य तक सीमित है. अंत में, असुरक्षित जानवरों के भीतर मानव कार्सिनोमा कोशिकाओं की जांच 8 असंभव हैं.
इन कारणों के लिए, हम एक coculture प्रणाली consi स्थापितMatrigel (3 डी सेल क्षेत्र) में एम्बेडेड एक organotypic माउस मस्तिष्क टुकड़ा और उपकला कोशिकाओं के डंक. 3 डी कार्सिनोमा सेल क्षेत्रों पड़ोसी मस्तिष्क के ऊतकों के आक्रमण की जांच के क्रम में सीधे अगले मस्तिष्क टुकड़ा किनारे करने के लिए रखा गया था. इस प्रतिदीप्ति द्वारा और भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा glial कोशिकाओं और कार्सिनोमा कोशिकाओं के बीच morphological परिवर्तन और बातचीत कल्पना करने के लिए हमें सक्षम बनाता है. Coculture प्रयोग के बाद, मस्तिष्क के ऊतकों या 3 डी सेल spheroids एकत्र किया जा सकता है और आगे आणविक विश्लेषण (जैसे QRT-पीसीआर, आईएचसी, या immunoblot) के साथ ही confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच के लिए के लिए इस्तेमाल किया. इस विधि मस्तिष्क स्लाइसें के लिए हानिकारक प्रभाव के बिना दिनों के लिए रहने वाले एक मस्तिष्क ऊतक के भीतर की घटनाओं पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है. मॉडल भी चयनात्मक दमन और किसी दिए गए जीनोटाइप के विशिष्ट प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक दाता ऊतक से कोशिकाओं द्वारा निवासी कोशिकाओं के प्रतिस्थापन की अनुमति देता है. अंत में, coculture मॉडल एक साध्य विकल्प हैलक्षित औषधीय जोड़तोड़ जब परीक्षण में विवो के दृष्टिकोण.
मस्तिष्क मेटास्टेसिस का पिछला ऊतकीय जांच विशेष रूप से astrocytes और microglia 13 के निवासी glial कोशिकाओं का तेजी से और कठोर परिवर्तन, प्रदर्शन किया. कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ इन परिवर्तनों और बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इस उपन्यास coculture प्रणाली अच्छी तरह से अनुकूल है. अन्य अनुसंधान क्षेत्रों में पहले से ही organotypic हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क के स्लाइस के साथ लंबे समय से चली आ रही अनुभव है. एक लाभ यह organotypic हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाने, सप्ताह के लिए व्यवहार्य और प्रभावी ढंग से दिन के लिए संरक्षित कर रहे हैं. 1991 में organotypic hippocampal टुकड़ा प्रणाली की Stoppini की शुरूआत के बाद से, यह व्यापक रूप से अपक्षयी रोगों के अनुसंधान में, उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, यह नया coculture प्रणाली ट्यूमर जीव विज्ञान 9,11 में आवेदनों की एक सीमा के साथ एक अच्छी तरह से स्थापित दृष्टिकोण के लिए एक संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है. संशोधन ट्यूमर आक्रमण वायुसेना के ग्रेड का मूल्यांकन करने के लिए हमें एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल की पेशकश कीइंटरफ़ेस विधि से उगाया terwards और संस्कृतियों आदर्श एक तीन आयामी संरचना की आवश्यकता है कि प्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं. कई तकनीकों अन्य कोशिकाओं के साथ organotypic hippocampal स्लाइस coculture के लिए इस्तेमाल किया गया है. ये बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं और organotypic मस्तिष्क टुकड़ा 14 के बीच एक अप्रत्यक्ष प्रणाली, और हिप्पोकैम्पस क्षेत्र 15 से दो अलग स्लाइस का एक सीधा coculture शामिल हैं. Glioma समुच्चय भी मस्तिष्क के स्लाइस के साथ 16 cocultured किया गया है. इन मॉडलों मस्तिष्क स्लाइसें में सेलुलर और आणविक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ट्यूमर कोशिकाओं, microglia और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के बीच सीधी, शारीरिक संपर्क की अनुमति नहीं है. इसके अलावा, इस विधि अस्थि मज्जा व्युत्पन्न परिधीय monocytes / मैक्रोफेज के प्रदूषण के बिना microglia के अवलोकन की अनुमति देता है. CCR2 और CX3CR1 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग होने के कारण यह monocytes पर हमले से निवासी microglia अंतर करना मुश्किल है कि इस तथ्य को एक महत्वपूर्ण सुधार हैउनके समान गुणों 17,18,19 पर आधारित है. कार्सिनोमा कोशिकाओं के intracerebral इंजेक्शन ट्यूमर प्रगति की जांच की अनुमति देता है, यह घिरे बृहतभक्षककोशिका कोशिकाओं की तरह मस्तिष्क निवासी microglia आबादी से या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न परिधीय monocytes / मैक्रोफेज 17 से ही शुरू करने के लिए के रूप में ज्यादा नहीं बता सकता. Kettenmann की टीम एक micromanipulator 20 के साथ मस्तिष्क स्लाइस में glioma कोशिकाओं inoculating है कि इसमें शामिल एक organotypic मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल पेश किया. हालांकि, प्राथमिक घातक gliomas metastatic कार्सिनोमा से कई संबंध में मतभेद है. सबसे पहले, घातक gliomas mesenchymal मूल के हैं, ट्यूमर और मस्तिष्क के ऊतकों के बीच कोई सीमा के साथ के रूप में एकल कोशिकाओं पर आक्रमण / तंत्रिका तंत्र के बाहर metastasize, और विस्थापित नहीं है. इसके विपरीत, infiltrative वृद्धि एक ठेठ रोग विशेषता है, और इस तरह के कार्सिनोमा आमतौर पर विस्थापित / साथियों के रूप में चढ़ाई. कोशिकाओं glial दूसरा, जबकि कार्सिनोमा अक्सर, मस्तिष्क में उपकला संरचनाओं के पुनर्निर्माण की कोशिशएक (छद्म) कैप्सूल से मस्तिष्क के ऊतकों से ट्यूमर को अलग करने का प्रयास करें. जैविक और रूपात्मक सुविधाओं पर विचार, घातक glioma और कार्सिनोमा की मेटास्टेसिस वास्तव में तुलना नहीं कर रहे. इन कारणों के लिए, हम संशोधित और हम मस्तिष्क टुकड़ा से सटे एक कार्सिनोमा सेल प्लग इंजेक्षन लेकिन coculture नहीं है जहां एक coculture प्रणाली विकसित की है. इसके अलावा, हम microglia ट्यूमर प्लग भरिये और आसानी से उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा बाद में पुष्टि की कि हो सकता है, जिसका अर्थ है microglial और ट्यूमर प्लग की सीमा पर astrocytic संचय मनाया. कैंसर की कोशिकाओं को विवो स्थिति में असली के लिए और BAUMERT और मस्तिष्क 21 metastases के साथ शव परीक्षण मामलों के 63% में एक घुसपैठ क्षेत्र में पाया गया है जो उनके सहयोगियों द्वारा किए गए एक अवलोकन करने के लिए तुलनीय है जो मस्तिष्क टुकड़ा, में आक्रमण.
क्योंकि लापता रक्त छिड़काव की इस संस्कृति में ही निवासी मैक्रोफेज / microglia कर रहे हैं. इसके अलावा, क्योंकि के मीटरissing टी कोशिकाओं और, इसलिए, अनुपस्थित allo जेट, मानव कार्सिनोमा कोशिकाओं भी असुरक्षित चूहे या चूहों के मस्तिष्क स्लाइसें (NMRI, बी -6, या Wistar) के साथ coculture के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस नग्न माउस मॉडल के लिए एक विकल्प के रूप में काम आ सकते हैं. 4-5 स्लाइस प्रत्येक माउस से प्राप्त किया जा सकता है, जानवरों की काफी कम संख्या मौजूदा इंजेक्शन मॉडलों की तुलना में, आवश्यक हैं. इसके अलावा, पशुओं metastatic रोग की एक लंबी अवधि के लिए पीड़ित नहीं है और वे repetitively 22 ऑपरेटिव प्रक्रियाओं से गुजरना नहीं है.
इस coculture प्रणाली के साथ, हम कैंसर कोशिकाओं द्वारा microglia की सक्रियता और कैंसर सेल आक्रमण को बढ़ावा देने की क्षमता का प्रदर्शन किया है. साथ ही, यह हमारे ज्ञान करने के लिए, microglia सक्रिय रूप कार्सिनोमा कोशिकाओं 23 परिवहन के लिए पाया गया है, पहली बार है.
इन सभी लाभों के बावजूद coculture प्रणाली, वास्तव में, यह भी सीमाएं हैं. यह अभी भी एक में इन विट्रो हैपूर्व उपनिवेश की स्थापना के लिए मेटास्टेसिस के इस कदम लापता मॉडल. क्योंकि छिड़काव की कमी की वजह से, यह परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है. इस प्रकार, परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक रास्ता रक्त मस्तिष्क बाधा 22,24 की नकल करने में विवो इंजेक्शन मॉडल या संशोधित Boyden कक्ष प्रणाली बाह्य मैट्रिक्स के साथ, HUVEC और astrocytes या तो उपयोग करने के लिए है. मस्तिष्क टुकड़ा coculture विधि अभी तक कई फायदे के साथ एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल और ऐसे उपनिवेशवाद का विश्लेषण के रूप में आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए एक संभावित है निवासी सेल की भूमिका पर ध्यान देने के साथ विशेष रूप से. (जैसे immunohistochemistry, confocal माइक्रोस्कोपी और समय चूक माइक्रोस्कोपी के रूप में) अन्य स्थापित तकनीकों के साथ संयोजन प्रत्यक्ष सेल करने वाली सेल बातचीत की जांच का समर्थन करता है. यह एक आसान विकल्प और अन्य तकनीकों के पूरक है और metastatic microenvironment द्वारा लगाया रूप cues और प्रभाव की जांच करने के लिए प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता, confocal और समय चूक माइक्रोस्कोपी के बारे में उनकी तकनीकी सलाह के लिए एंड्रियास Wodarz और स्टीफ़न Heermann के लिए Chalid Ghadban धन्यवाद. लेखकों में से किसी के लिए हितों का कोई विवाद नहीं है. इस काम Dres द्वारा, Forschergruppe 942 की परियोजना 2 (FOR942 द्विपक्षीय 703/3-1) में जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा वित्त पोषित है. बायर-Stiftung (बाडेन Württembergischer Krebspreis, जर्मनी) और मेडिसिन के संकाय, Georg-August-विश्वविद्यालय गौटिंगेन, जर्मनी की रिसर्च प्रोग्राम द्वारा.
Material Name | Company | Catalogue number | Comment |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Darmstadt,Germany | 24020 | |
Minimum essential medium (MEM) | Gibco, Darmstadt , Germany | 32360 | |
RPMI-1640 | PAA Laboratories Inc., Cölbe, Germany | E15-840 | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Pan Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 | |
Normal horse serum (NHS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 16050-122 | |
Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 10091148 | |
Glucose | B. Braum, Melsungen, Germany | ||
L-Glutamine-Penicillin-Streptomycin solution | Sigma, Steinheim, Germany | G1146 | |
Vibratome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica VT1200S | |
Microtome | Leica, Wetzlar, Germany | Leica SM 2000R | |
Polycarbonate membrane | BD Falcon, Heidelberg,Germany | 353090 | transwell membrane insert (0.4 μm pore size) |
ECM gel | Trevigen, R&D, Wiesbaden-Nordenstadt, Germany | 3432-005-01 | Basement membrane extract |
Metallic spacer | Kig GmbG, Kirkel, Germany | DIN 433 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | LSM 510 | |
Time-lapse microscope and camera | Leica, Wetzlar, Germany | DMI 6000B microscope and a DFC 350 FX CCD camera | |
Anatomy microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Stemi SV11 | |
Paraformaldehyde | Merck, Darmstadt, Germany | 1.04005.1000 | |
Mouse monoclonal anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antibody | Sigma, Steinheim, Germany | G3893 | |
Goat anti-mouse IgG, F(ab')2– TRITC | Santa Cruz, Heidelberg, Germany | SC3796 | |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 conjugate | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 132450 | |
DAPI (4',6'-diamidino-2-phenylindole dihyfrochloride) | Sigma, Steinheim, Germany | D8417 | |
Fluorescent mounting medium | DAKO, Glostrup, Denmark | S3023 |