Två-foton Kalcium Imaging i möss Navigera en Virtual Reality Miljö
Summary
Här beskriver vi de experimentella förfaranden som ingår i två-photon avbildning av musen cortex under uppförande i en virtuell verklighet miljö.
Abstract
Under de senaste åren har två-photon avbildning blivit ett ovärderligt verktyg i neurovetenskap, eftersom det gör det möjligt för kroniskt mäta aktiviteten av genetiskt identifierade celler under uppförande 1-6. Här beskriver vi metoder för att utföra två-photon avbildning i musen cortex medan djuret navigerar en virtuell verklighet miljö. Vi fokuserar på de aspekter av de experimentella procedurer som är nyckeln till att avbildning i en beter djur i väl upplysta virtuell miljö. De viktigaste problem som uppstår i denna experimentuppställning som vi här adressen är: minimera hjärnrörelserelaterade artefakter, minimerar ljusläckage från den virtuella verkligheten projektionssystem, och minimera laser inducerad vävnadsskada. Vi ger också prov programvara för att styra den virtuella verkligheten miljön och att göra eleven spårning. Med dessa förfaranden och resurser bör det vara möjligt att konvertera en vanlig två-photon mikroskop för användning i beter möss.
Introduction
Två-foton avbildning av kalcium indikatorer (genetiskt kodade som GCaMP5 7 eller R-GECO 8, eller syntetiska färgämnen som OGB eller Fluo4) har vuxit fram som en kraftfull metod för att mäta nervaktivitet i beter möss 1-6. Den möjliggör samtidig mätning av aktiviteten av hundratals celler vid nära enda aktionspotentialens upplösning, upp till ca 800 | im under hjärnans yta 9,10. Dessutom, med hjälp av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) nervaktivitet kan mätas kroniskt 5,11,12, och i genetiskt definierade celltyper 13. Tillsammans, dessa metoder ger en grad av tids-och rumsupplösning som öppnar upp en mängd nya möjligheter att studera neuronal beräkning in vivo.
Kirurgiska ingrepp är nödvändigt att avslöja och märka mushjärnan för avbildning. Celler är typiskt transfekteras med hjälp av en rekombinant adenoassocierat vir oss (AAV)-systemet för Geci leverans och en kraniell fönster är implanterat över injektionsstället för att få optisk tillgång till hjärnan. En huvudstången fästs sedan vid skallen för huvudet fixering under två-foton-mikroskop. Utformningen och genomförandet av dessa steg är viktigt eftersom de flesta av problemen med vaken avbildning uppstår instabilitet i beredningen. Helst det förfarande som beskrivs här bör möjliggöra för kronisk avbildning av upp till flera månader efter operationen.
För att aktivera visuellt styrd beteende under två-photon avbildning, sitter huvudet fast musen på en luft stöds sfärisk löpband, som den kan använda för att navigera en virtuell verklighet miljö. Locomotion av musen på löpbandet är kopplad till rörelse i den virtuella miljön som visas på en toroid skärm omger musen 14,15. Beteendevariabler såsom förflyttning, visuell stimulans, och elevläge kan spelas in 6.
t "> Vi beskriver de förfaranden som är involverade i kronisk två-photon avbildning i möss utforska en virtuell verklighet miljö De viktigaste punkterna som tas upp är:. minskning av rörelseartefakter, minskning av ljusläckage, maximering av antalet samtidigt inspelade celler, och minimering av fotoskador. Vi tillhandahåller även information om att installera luft-stöd löpband, elev spårning, och den virtuella verkligheten miljön. De förfaranden som beskrivs här kan användas för avbildning fluorescerande cellpopulationer i huvudet fast möss i ett potentiellt stort antal beteendeparadigm .Protocol
Representative Results
Discussion
Nyckeln till framgång för beteende två-foton-avbildning är stabiliteten av beredningen på två sätt:
- Under dagarna efter fönster implantation, kan inflammatoriska reaktioner i vävnaden leder till förbättring av bildandet av granulationsvävnad och brosk som kommer att försvåra eller till och med förhindra avbildning.
- Under experimentet hjärnan måste vara tillräckligt stabil för att förhindra rörelseartefakter förvränger neural aktivitet relaterad fluorescenssignal.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Friedrich Miescher Institutet för biomedicinsk forskning, Max Planck-sällskapet, och Human Frontiers Science Program.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
Referências
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
