生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中
Summary
神経芽細胞の遊走は、出生後の神経発生における基本的なイベントです。我々は、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよび急性脳スライスのタイムラプスイメージングを使用して、移行のその後の視覚化によって神経芽細胞の効率的な標識のためのプロトコルを記述します。私たちは、ビデオトラッキングによる神経芽細胞の動態を定量的に分析するための説明が含まれています。
Abstract
脳室下帯（SVZ）は、出生後の脳内の主要な神経性のニッチの一つです。ここで、神経前駆細胞は増殖し、嗅球（OB）に向かって吻側細胞移動（RMS）に沿って移動することができる神経芽細胞を生じさせる。この長距離移動は、OBにおける新生ニューロンのその後の成熟に必要であるが、このプロセスを制御する分子メカニズムは未だ不明であるされている。神経芽細胞の運動性を制御するシグナル伝達経路を調査すると、神経発生における基本的なステップを理解するのに役立つだけでなく、治療上の再生能力を持っている、損傷、脳卒中、または変性の影響を受けた脳の部位を対象とし、これらの神経芽細胞の能力を与えられたことだけではなく。
本稿では、我々はin vivoでの出生後のエレクトロポレーションおよびマウスのRMSにおける神経芽細胞の遊走のその後のタイムラプスイメージングのための詳細なプロトコルを記述します。出生後のエレクトロポレーションを効率的にSVZ前駆をトランスフェクトすることができる今度は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を生成する細胞が、。急性脳スライス培養での共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いて、神経芽細胞の遊走は、密接に、生体内の条件に似た環境で監視することができます。また、神経芽細胞の運動性を追跡し、定量的に分析することができる。一例として、我々は、RMSに沿って移行する神経芽細胞を標識し、可視化するために、GFP発現プラスミドのin vivo出生後のエレクトロポレーションを使用する方法について説明します。 loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウトマウスのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーションはまた、目的の遺伝子を標的化するために使用することができる。急性脳切片培養物の薬理学的操作は、神経芽細胞遊走における異なるシグナル伝達分子の役割を調べるために行うことができる。タイムラプスイメージングと生体内エレクトロポレーションに結合させることにより、我々は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構を理解し、開発に貢献したいと考えてい小説のMENTは、脳の修復を促進することに近づく。
Introduction
哺乳動物の脳では、新しいニューロン（神経新生）を生成する、2つの領域、側脳室および海馬1の歯状回における下帯の脳室下帯（SVZ）を中心に、出生後に発生します。近年では集まったかなりの証拠は、海馬や嗅球メモリ機能1-3出生後の神経新生の重要な役割をサポートしています。重要なのは、出生後の神経新生はまた、治療のため神経変性疾患との関係の可能性、および脳4-6で負傷部位に移動する神経芽細胞の能力を保持している。
脳室下帯（SVZ）は最近、重要な神経性のニッチとして浮上している。 SVZ由来の神経芽細胞は、この出生後の脳の1,7,8の中で最も長い移行プロセス作り、吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を介して嗅球（OB）に向かって移動。哺乳類SVZ / RMS / OBシステムになっていますこのような増殖、遊走及び分化1,8などの神経発生における様々なステップを、研究するための有用なモデル。多くの増殖因子および細胞外の合図は、RMSに沿って、SVZニューロン新生と移動を調節するが、細胞内の分子メカニズムは今のところ、完全に1,9を理解しているからである。 RMSに沿って適切な移行が新生ニューロン10のその後の成熟のために重要である。さらに、いくつかの研究は、SVZ由来の神経芽細胞は、脳損傷部位4-6,11-13にRMSから移動できることが示されている。このように、神経芽細胞の遊走を制御するシグナル伝達機構を研究することは、神経発生を理解するだけでなく、潜在的な治療用途のみならず基本である。
ここでは、in vivoでの出生後のエレクトロポレーションによってSVZ神経前駆細胞を標識し、タイムラプス回転するディスク共焦点microscoを使用して急性脳スライス培養のRMSに沿ってそれらの移動を監視するための詳細なプロトコルを記述PY。エレクトロポレーションは広く、胚から成体の段階14〜18までの発達の研究に使用されている。それは、SVZ神経前駆細胞を標的とし、操作するための強力なツールであり、ウイルスベクターやトランスジェニックモデル1,15,19,20の世代の定位注入に安く、かなり高速な代替を表しています。これは、手術を必要とし、高い生存率を有していない比較的簡単な手順である。 loxPシステムを用いたマウスでのshRNAまたはCREリコンビナーゼ発現プラスミドのエレクトロポレーション遺伝モデルは、従って、成体神経新生のための有用なツールを表すこと21,22を研究し 、目的の遺伝子を標的とするか、SVZ前駆細胞の永久的な標識化を達成するために使用することができる。
無傷の脳内でのイメージングのRMS神経芽細胞の遊走は、現在の技術的な制限のため、依然として困難である。しかしながら、この方法は適切なシステム経験を提供する急性脳切片の共焦点スピニングディスクタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができるEMは、密接に薬理学的操作23,24にも適用できるin vivoでの条件に似ている。タイムラプスイメージングを用いたin vivo生後のエレクトロポレーションでの結合は、神経芽細胞の運動性を制御する分子機構の理解を容易にし、脳の修復を促進するための新しいアプローチの開発に貢献していきます。
Protocol
Representative Results
Discussion
RMSに沿って神経前駆細胞の効率的な移行は、機能的なニューロン10に彼らのその後の成熟を 保証します。 OBに向けた神経前駆細胞の顕著な流れは、人間の初期の段階で表示され、出生後早期人間の脳の発達27に重要な役割を果たしている可能性が高い。さらに、これらの細胞は傷害および神経変性4,28の影響を受けた脳の部位を標的とすることができます。リアル…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MSとYZはKCLとKCL-中国の博士課程のstudentshipsによってサポートされています。 MOは、バイオテクノロジー·生物科学研究評議会の博士課程の学生の身分によって資金を供給された。私たちは、エレクトロポレーションについて貴重なアドバイス勝岡部と純一宮崎PCX-EGFPプラスミドおよびアランChedotalとアテナイプシランティに感謝します。
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
Referências
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neurociência. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
