In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor
Summary
Neuroblast migration är en grundläggande händelse i postnatal neurogenes. Vi beskriver ett protokoll för effektiv märkning av neuroblaster genom in vivo-postnatal elektroporering och efterföljande visualisering av sin vandring med hjälp av time-lapse avbildning av akut hjärnan skivor. Vi inkluderar en beskrivning för kvantitativ analys av neuroblast dynamik genom videospårning.
Abstract
Den subventrikulära zonen (SVZ) är en av de viktigaste neurogena nischer i postnatal hjärnan. Här, neurala stamceller förökar sig och ge upphov till neuroblaster som kan röra sig längs rostralt vandrande ström (RMS) mot luktbulben (OB). Detta långväga migration behövs för den efterföljande mognad av nyfödda nervceller i OB, men de molekylära mekanismer som reglerar denna process är fortfarande oklart. Undersöka de signalvägar som styr neuroblast motilitet kan inte bara hjälpa till att förstå ett grundläggande steg i neurogenesis, men också ha terapeutisk regenerativ potential, med tanke på möjligheterna för dessa neuroblaster att rikta hjärn platser som drabbats av skador, stroke eller degeneration.
I detta manuskript beskriver vi ett detaljerat protokoll för in vivo-postnatal elektroporering och efterföljande tidsförlopp avbildning av neuroblast migration i mus RMS. Postnatal elektroporation kan effektivt transfektera SVZ gångareceller, som i sin tur genererar neuroblaster som migrerar längs RMS. Använda konfokala spinning disk tidsförlopp mikroskopi på akut hjärn slice kulturer, kan neuroblast migration följas i en miljö som liknar nära in vivo skick. Dessutom kan neuroblast motilitet spåras och analyseras kvantitativt. Som ett exempel beskriver vi hur man använder in vivo postnatal elektroporering av en GFP-uttryckande plasmid för att märka och visualisera neuroblaster som migrerar längs RMS. Elektroporering av shRNA eller Cre-rekombinas-uttryckande plasmider i villkorknockoutmöss med användning av loxP-systemet kan också användas för att rikta generna av intresse. Farmakologisk manipulation av akut hjärn slice kulturer kan utföras för att undersöka betydelsen av olika signalmolekyler i neuroblast migration. Genom att koppla in vivo elektroporering med time-lapse avbildning, hoppas vi att förstå de molekylära mekanismer som styr neuroblast rörlighet och bidra till att utvecklalingen av nya metoder för att främja hjärnans reparation.
Introduction
I däggdjurshjärnan, inträffar alstrandet av nya nervceller (neurogenes) efter födseln huvudsakligen i två regioner, den subventrikulära zonen (SVZ) hos de laterala ventriklarna och subgranular zonen i gyrus dentatus i hippocampus 1. Betydande bevis som samlats in under de senaste åren stöder en kritisk roll för postnatal neurogenes i hippocampus och luktloben minnesfunktioner 1-3. Huvudsakligen har postnatal neurogenes även terapeutisk potential på grund av sin relation med degenerativa neurologiska sjukdomar, och förmågan av neuroblaster att migrera till drabbade områden i hjärnan 4-6.
Den subventrikulära zonen (SVZ) har nyligen dykt upp som en viktig neurogen nisch. SVZ-härledda neuroblaster vandrar mot luktbulben (OB) via den rostrala migrationsströmmen (RMS), vilket gör detta den längsta migrationsprocessen i postnatal hjärn 1,7,8. Den däggdjurs SVZ / RMS / OB-systemet har blivit enanvändbar modell för att studera olika stegen i neurogenes, såsom tillväxt, migration och differentiering 1,8. Många tillväxtfaktorer och extracellulära signaler reglerar SVZ neurogenes och migration längs RMS, men de intracellulära molekylära mekanismerna är långt ifrån helt klar 1,9. Korrekt migration längs RMS är avgörande för den efterföljande mognaden av nyfödda nervceller 10. Dessutom har vissa studier visat att SVZ-härledda neuroblaster kan migrera ut ur RMS till hjärnskada platser 4-6,11-13. Således undersöker signaleringsmekanismer reglerande neuroblast migration är grundläggande inte bara för att förstå neurogenes utan också för potentiella terapeutiska tillämpningar.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att märka SVZ neurala stamceller genom in vivo-postnatal elektroporering och övervaka sin vandring längs RMS i akut hjärn skiva kulturer med hjälp av time-lapse spinning disk confocal microscopy. Elektroporation används ofta i utvecklingsstudier från foster till vuxen stegen 14-18. Det är ett kraftfullt verktyg för att rikta in och manipulera SVZ neurala stamceller och representerar en billigare och betydligt snabbare alternativ till stereotaktisk injektion av virala vektorer eller generering av transgena modeller 1,15,19,20. Det är ett relativt enkelt förfarande som inte kräver kirurgi och har hög överlevnad. Elektroporation av shRNA eller Crerekombinas-uttryckande plasmider i mus genetiska modeller som utnyttjar LoxP systemet kan användas för att rikta gener av intresse eller för att uppnå permanent märkning av SVZ stamceller, vilket representerar ett användbart verktyg för vuxna neurogenes studier 21,22.
Imaging RMS neuroblast migration i den intakta hjärnan är fortfarande en utmaning på grund av gällande tekniska begränsningar. Däremot kan processen övervakas med hjälp av konfokal spinning disk tidsförlopp mikroskopi av akut hjärnan skivor, som ger en lämplig system nära liknar tillståndet också mottaglig för farmakologisk manipulation 23,24 in vivo. Koppling in vivo-postnatal elektroporering med time-lapse avbildning kommer att underlätta förståelsen av de molekylära mekanismer som styr neuroblast rörlighet och bidra till utvecklingen av nya metoder för att främja hjärnans reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv migration av neurala stamceller längs RMS garanterar deras efterföljande mognad i funktionella nervceller 10. Framstående strömmar av neurala stamceller riktade mot OB är synliga i människans linda och kommer sannolikt att spela en viktig roll i tidig postnatal mänskliga hjärnans utveckling 27. Dessutom är dessa celler kan rikta platser som drabbats av skada och neurodegeneration 4,28 hjärna. Att kunna övervaka i realtid effekten av genmanipulation på neuroblast dyna…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS och YZ stöds av KCL och KCL-Kina doktorandtjänster. MO finansierades av en bioteknik och Biological Sciences Research Council doktorand. Vi tackar Masaru Okabe och Jun-ichi Miyazaki för PCX-EGFP plasmid och Alain Chedotal och Athena Ypsilanti för värdefulla råd om elektroporation.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
Referências
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and. 11, 339-350 (2010).
- Lazarini, F., Lledo, P. M. Is adult neurogenesis essential for olfaction?. Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).
- Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8, 963-970 (2002).
- Emsley, J. G., Hagg, T. alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain. Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).
- Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).
- Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).
- Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis. Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).
- Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).
- Gotts, J. E., Chesselet, M. F. Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury. J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).
- Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury. Brain Res. 996, 213-226 (2004).
- Romanko, M. J., et al. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS One. 3, e1883 (2008).
- Barnabe-Heider, F., et al. Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation. Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Pathania, M., et al. miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons. PloS One. 7, e38174 (2012).
- dal Maschio, M., M, , et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nat. Commun. 3, 960 (2012).
- Oudin, M. J., et al. Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. Neonatal subventricular zone electroporation. J. Vis. Exp. (72), e50197 (2013).
- Nam, S. C., et al. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy. Front. Neurosci. 5, 30 (2011).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Dev. 6, 13 (2011).
- Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone. J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).
- Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
- Tattersfield, A. S., et al. Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington’s disease. Neurociência. 127, 319-332 (2004).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061 (2012).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Schaar, B. T., McConnell, S. K. Cytoskeletal coordination during neuronal migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).
- Valiente, M., Marin, O. Neuronal migration mechanisms in development and disease. Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).
- Comte, I., et al. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
- Sonego, M., et al. Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain. J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).
