Time-lapse mikroskopi og billedbehandling teknikker blev brugt til at observere og analysere fibroblast-medieret gel komprimering og fibrin fiber justering i en miljøkontrolleret bioreaktor over en 48 timers periode.
Celler indlejret i kollagen og fibrin geler vedhæfte og udøve trækkraft kræfter på fibrene i gelen. Disse kræfter kan føre til lokal og global reorganisering og justering af gelmikrostrukturen. Denne proces fortsætter på en kompleks måde, der til dels afhænger af samspillet mellem cellernes placering, gelens geometri og de mekaniske begrænsninger på gelen. For bedre at forstå, hvordan disse variabler producerer globale fiberjusteringsmønstre, bruger vi DIC-mikroskopi (time-lapse differential interference contrast) kombineret med en miljøstyret bioreaktor til at observere komprimeringsprocessen mellem geometrisk fordelte explants (klynger af fibroblaster). Billederne analyseres derefter med en brugerdefineret billedbehandlingsalgoritme for at få kort over stammen. Oplysningerne fra denne teknik kan bruges til at undersøge mekanobiologien af forskellige cellematrixinteraktioner, hvilket har vigtige konsekvenser for forståelsesprocesser i sårheling, sygdomsudvikling og vævstekniske applikationer.
Et vigtigt redskab til at studere celle-matrix interaktioner er cellen befolket kollagen gel1,2. Gelen giver et 3D-miljø, der er tættere på vævets in vivo-karakter og bedre egnet til at forstå celleadfærd end traditionelle 2D-kulturer3. Tidlige undersøgelser, hvor fibroblaster blev homogent fordelt i en kollagen gel fandt, at cellerne hurtigt konsolidere kollagen fibre og komprimere gel4,5. Den kontraktile fibroblaster i frit flydende geler derefter overgangen til en hvilende tilstand kort efter gelen er fuldt nået komprimering1,6,7. Fibroblasterne i geler, der er begrænset ved grænserne, forbliver i en aktiv, syntetisk tilstand8, og de genererer fiberjustering på en måde, der er afhængig af gelgeometri og eksterne begrænsninger5,9. Forskelle i celleaktivitet synes at være et resultat af den interne spænding (eller mangel på samme), der udvikler sig som cellerne udøver trækkraft kræfter via integrins på kollagen fibre i gelen.
En variant af denne teknik indebærer at placere fibroblast explants(dvs. klumper af celler) en afstand fra hinanden i en kollagen gel og observere celle-matrix interaktioner og den gradvise udvikling af fiber tilpasning mellem explants (undertiden kaldet ligament-lignende stropper)10-12. Den primære fordel ved det eksplante system er, at det giver en mulighed for at arrangere cellerne i enkle geometriske mønstre, hvilket gør det lettere at visualisere og undersøge de mekanismer, der ligger til grund for celledrevet fiberjustering. Disse tilpasningsmønstre – som primært afhænger af samspillet mellem celletrækkræfter, celle rumlig distribution, gelgeometri og de mekaniske begrænsninger på gelen – er vigtige at forstå, fordi de spiller en central rolle i den globale vævsorganisation, mekanisk funktion og lokalt mekanisk miljø13.
Inden for vævsteknik involverer en strategi for fremstilling af mekanisk funktionelle, manipulerede væv at kontrollere fiberjusteringsmønsteret, der udvikler sig fra cellekomprimering, så det manipulerede væv besidder fiberjustering, der efterligner det indfødte væv14,15. En sådan tilpasning menes nødvendig for manipuleret væv til at kopiere den komplekse mekaniske adfærd indfødte væv. En ændring af denne strategi er at erstatte kollagen gel med en fibrin gel16. Fibrin gelen udvikler et lignende justeringsmønster som en kollagengel under komprimering. Over tid fibrin nedbrydes og erstattes med celle-syntetiseret ECM, der følger den oprindelige fibrin fiber justering mønster. Den resulterende konstrueret konstruktion har væsentligt forbedret mekaniske egenskaber i forhold til kollagen gel afledt konstruktioner17.
Tilpasningsprocessen og efterfølgende ombygningshændelser i fibrin geler fortsætter på en kompliceret og dårligt forstået måde. For bedre at karakterisere disse interaktioner og deres virkning på celleadfærd og ECM-remodeling har vi udviklet en procedure, der er baseret på explant-metoden. I denne metode er fibroblast explants placeret på en fibrin gel i forskellige geometriske mønstre. Gelerne vedligeholdes i en miljøkontrolleret, mikroskopmonteret bioreaktor18, og komprimerings- og fiberjusteringsprocessen overvåges med time-lapse differentialinterferenskontrastkontrast (DIC) mikroskopi. Forskydningsfelter kvantificeres med brugerdefinerede algoritmer. De data, der er opnået fra disse eksperimenter, har vidtrækkende konsekvenser for en række processer, herunder optimering af vævstekniske strategier, forbedring af sårheling og behandling af patologisk vævs remodeling.
Denne protokol blev udviklet med det formål at observere og kvantificere de mekanikere, der er involveret i cellemedieret ECM-ombygning. Sådanne processer ligger til grund for en række biologiske fænomener og har stor betydning for vævevæv2,22, hvilket reducerer ar1,23og forstår patologisk vævs remodeling12,24. Brugen af time-lapse DIC mikroskopi giver en mulighed for at løse og kvantificere forskydning og tilpasning af fibrin fibre, der opstår som følge af celle trækkraft kr?…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker George Giudice og Steven Eliason for at donere menneskelige dermal fibroblaster og Ramesh Raghupathy for hjælp med belastningssporingsalgoritmen. Støtte til dette arbejde blev ydet af en U. S. Department of Education Graduate Assistance i områder af National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Sigma-Aldrich | F8630 | |
Sigma-Aldrich | T4648 | |
Gibco | 11965-092 | |
Gibco | 15140-122 | |
Sigma-Aldrich | A2942 | |
Sigma-Aldrich | H0887 | |
Sigma-Aldrich | 223506 | |
Gibco | 25200-056 | |
Invitrogen | 3000 | |
Lonza | DE14-701F | |
Molecular Probes | F8858 | |
GIBCO | A10483-01 | |
GIBCO | 11430-030 | |
Fisher-Scientific | SS264-1 | |
Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
Biotense Bioreactor | ADMET | |
Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |