देख रहा है और फाइब्रोब्लास्ट-मध्यस्थता फिब्रिन जेल कॉम्पैक्टेशन की मात्रा
Summary
समय-चूक माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण तकनीकों का उपयोग 48 घंटे की अवधि में पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित बायोरिएक्टर में फाइब्रोब्लास्ट-मध्यस्थता जेल कॉम्पैक्टेशन और फाइब्रिन फाइबर पुनर्संरेखण का निरीक्षण और विश्लेषण करने के लिए किया गया था।
Abstract
कोलेजन और फाइब्रिन जैल में एम्बेडेड कोशिकाएं जेल के तंतुओं पर कर्षण बलों को संलग्न और डालती हैं। ये ताकतें स्थानीय और वैश्विक पुनर्गठन और जेल माइक्रोस्ट्रक्चर के पुनर्संरेखण का कारण बन सकती हैं। यह प्रक्रिया एक जटिल तरीके से आगे बढ़ती है जो कोशिकाओं के स्थान, जेल की ज्यामिति और जेल पर यांत्रिक बाधाओं के बीच परस्पर क्रिया पर निर्भर है। बेहतर ढंग से समझने के लिए कि ये चर वैश्विक फाइबर संरेखण पैटर्न का उत्पादन कैसे करते हैं, हम ज्यामितीय रूप से दूरी वाले एक्सप्लांट (फाइब्रोब्लास्ट के समूह) के बीच कॉम्पैक्टेशन प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित बायोरिएक्टर के साथ मिलकर समय-चूक अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं। छवियों को फिर तनाव के नक्शे प्राप्त करने के लिए एक कस्टम छवि प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ विश्लेषण किया जाता है। इस तकनीक से प्राप्त जानकारी का उपयोग विभिन्न सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन के मशीनोबायोलॉजी की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें घाव भरने, रोग विकास और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं।
Introduction
सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण सेल आबादी वाले कोलेजन जेल1,2है। जेल एक 3 डी वातावरण प्रदान करता है जो ऊतक के वीवो चरित्र के करीब है और पारंपरिक 2डीसंस्कृतियोंद्वारा पेश की तुलना में सेल व्यवहार को समझने के लिए बेहतर अनुकूल है। शुरुआती अध्ययनों में फाइब्रोब्लास्ट को कोलेजन जेल के भीतर समरूप रूप से वितरित किया गया था, पाया गया कि कोशिकाएं तेजी से कोलेजन फाइबर को मजबूत करती हैं और जेल4,5को कॉम्पैक्ट करती हैं। मुक्त फ्लोटिंग जैल में अनुबंधित फाइब्रोब्लास्ट फिर जेल पूरी तरह से कॉम्पैक्टेशन1,6,7तक पहुंचने के तुरंत बाद एक शांत अवस्था में संक्रमण करते हैं। जैल में फाइब्रोब्लास्ट जो सीमाओं पर विवश हैं, एक सक्रिय, सिंथेटिक राज्य8 में रहते हैं और वे जेल ज्यामिति और बाहरी बाधाओं पर निर्भर तरीके से फाइबर संरेखण उत्पन्न करते हैं5,9। कोशिका गतिविधि में अंतर आंतरिक तनाव (या उसके अभाव) का परिणाम प्रतीत होता है जो विकसित होता है क्योंकि कोशिकाएं जेल में कोलेजन फाइबर पर इंटीग्रिटीज के माध्यम से कर्षण बल डालती हैं।
इस तकनीक के एक संस्करण में फाइब्रोब्लास्ट एक्सप्लांट्स(यानी कोशिकाओं के झुरमुट) को कोलेजन जेल के भीतर अलग-अलग दूरी और सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन और एक्सप्लांट (कभी-कभी स्नायु-जैसी पट्टियां कहा जाता है) के बीच फाइबर संरेखण का क्रमिक विकास10-12शामिल है। एक्सप्लांट सिस्टम का प्राथमिक लाभ यह है कि यह कोशिकाओं को सरल ज्यामितीय पैटर्न में व्यवस्थित करने की अनुमति देता है, जिससे कोशिका-चालित फाइबर पुनर्संरेखण में अंतर्निहित तंत्र की कल्पना करना और जांच करना आसान हो जाता है। ये संरेखण पैटर्न – जो मुख्य रूप से सेल कर्षण बलों, सेल स्थानिक वितरण, जेल ज्यामिति और जेल पर यांत्रिक बाधाओं के बीच परस्पर क्रिया पर निर्भर हैं – समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं क्योंकि वे वैश्विक ऊतक संगठन, यांत्रिक कार्य और स्थानीय यांत्रिक वातावरण13में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं।
ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में, यांत्रिक रूप से कार्यात्मक, इंजीनियर-ऊतकों के उत्पादन के लिए एक रणनीति में फाइबर संरेखण पैटर्न को नियंत्रित करना शामिल है जो सेल कॉम्पैक्टेशन से विकसित होता है ताकि इंजीनियर ऊतक के पास फाइबर संरेखण हो जो देशी ऊतक14,15की नकल करता है। इस तरह के संरेखण को मूल ऊतकों के जटिल यांत्रिक व्यवहार को दोहराने के लिए इंजीनियर ऊतकों के लिए आवश्यक माना जाता है। इस रणनीति का एक संशोधन कोलेजन जेल को एक फाइब्रिन जेल16से बदलना है। फाइब्रिन जेल कॉम्पिटिशन के दौरान कोलेजन जेल के समान संरेखण पैटर्न विकसित करता है। समय के साथ फाइब्रिन को अपमानित किया जाता है और सेल-संश्लेषित ईसीएम के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है जो प्रारंभिक फाइब्रिन फाइबर संरेखण पैटर्न का पालन करता है। परिणामस्वरूप इंजीनियर निर्माण में कोलेजन जेल17की तुलना में यांत्रिक गुणों में काफी सुधार हुआ है ।
संरेखण प्रक्रिया और बाद में फाइब्रिन जैल में पुनः तैयार करने की घटनाएं एक जटिल और खराब समझ तरीके से आगे बढ़ती हैं। इन इंटरैक्शन और सेल व्यवहार और ईसीएम रीमॉडलिंग पर उनके प्रभाव को बेहतर मानते हुए, हमने एक प्रक्रिया विकसित की है जो एक्सप्लांट विधि पर आधारित है। इस विधि में, फाइब्रोब्लास्ट एक्सप्लांट विभिन्न ज्यामितीय पैटर्न में फाइब्रिन जेल पर तैनात हैं। जैल को पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित, माइक्रोस्कोप-घुड़सवार बायोरिएक्टर18में बनाए रखा जाता है, और कॉम्पैक्टेशन और फाइबर रीअलाइनमेंट की प्रक्रिया को समय-चूक अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी के साथ निगरानी की जाती है। विस्थापन क्षेत्रों को कस्टम एल्गोरिदम के साथ निर्धारित किया जाता है। इन प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों में कई प्रक्रियाओं के लिए व्यापक निहितार्थ हैं, जिनमें ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों का अनुकूलन, घाव भरने में सुधार और पैथोलॉजिकल ऊतक रीमॉडलिंग का इलाज शामिल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल सेल-मध्यस्थता ईसीएम रीमॉडलिंग में शामिल यांत्रिकी को देखने और मात्रा निर्धारित करने के उद्देश्य से विकसित किया गया था। इस तरह की प्रक्रियाएं कई जैविक घटनाओं को रेखांकित करती हैं और2,22</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जॉर्ज गिडहिम और स्टीवन एलियासन को स्ट्रेन ट्रैकिंग एल्गोरिदम के साथ मदद के लिए ह्यूमन डर्मल फाइब्रोब्लास्ट और रमेश रघुपति को दान करने के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम के लिए सहायता राष्ट्रीय आवश्यकता फैलोशिप (GAANN P200A120071) के क्षेत्रों में एक अमेरिकी शिक्षा स्नातक सहायता विभाग द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
Referências
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