線維芽細胞媒介フィブリンゲル圧縮の観察と定量
Summary
時間経過顕微鏡と画像処理技術は、48時間の期間にわたって環境制御バイオリアクターにおける線維芽細胞媒介ゲル圧縮およびフィブリン線維再調整を観察し、分析するために使用された。
Abstract
コラーゲンおよびフィブリンゲルに埋め込まれた細胞は、ゲルの繊維に牽引力を加え、作用します。これらの力は、ゲル微細構造の局所およびグローバルな再編成および再編成につながる可能性があります。このプロセスは、細胞の位置、ゲルの幾何学的形状、およびゲルの機械的拘束との相互作用に部分的に依存する複雑な方法で進みます。これらの変数がグローバルな繊維アライメントパターンを生成する方法をよりよく理解するために、我々は、環境制御されたバイオリアクターと組み合わせたタイムラプス差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を使用して、幾何学的に間隔をあけた外植(線維芽細胞のクラスター)間の圧縮プロセスを観察する。次に、画像をカスタム画像処理アルゴリズムで分析し、歪みのマップを取得します。この技術から得られた情報は、創傷治癒、疾患の発生、および組織工学の応用におけるプロセスを理解する上で重要な意味を持つ様々な細胞マトリックス相互作用のメカノバイオロジーを調査するために使用することができる。
Introduction
細胞とマトリックスの相互作用を研究するための重要なツールは、細胞に取り込まれたコラーゲンゲル1,2である。ゲルは、組織の in vivo 特性に近く、従来の2D培養3によって提供されるよりも細胞の挙動を理解するのに適した3D環境を提供する。線維芽細胞がコラーゲンゲル内に均一に分布していた初期の研究では、細胞がコラーゲン線維を急速に統合し、ゲル4,5をコンパクト化することを発見した。フリーフローティングゲルの収縮線維芽細胞は、ゲルが完全に圧縮1,6,7に達した直後に静止状態に移行する。境界で拘束されたゲル中の線維芽細胞は活性な合成状態8のままであり、ゲル幾何学と外部拘束に依存する方法で繊維アライメントを生成する5,9。細胞活性の違いは、細胞がゲル内のコラーゲン線維にインテグリンを介して牽引力を発揮するにつれて発症する内部張力(またはその欠如)の結果であるように思われる。
この技術の変形は、線維芽細胞の外植体(すなわち細胞の塊)をコラーゲンゲル内に離れた距離に配置し、細胞とマトリックスの相互作用を観察し、外植体(靭帯状ストラップと呼ばれることもある)10-12の間の繊維アライメントの段階的な発達を含む。外植システムの主な利点は、細胞を単純な幾何学的パターンに配置できるため、細胞駆動型繊維再調整の基礎となるメカニズムをより簡単に視覚化して調査できることです。これらのアライメントパターンは、主に細胞牽引力、細胞空間分布、ゲル形状、およびゲル上の機械的制約間の相互作用に依存するものであり、グローバル組織組織、機械的機能、および局所的な機械環境における中心的な役割を果たすため、理解することが重要である。
組織工学の分野では、機械的に機能的で工学的組織を製造するための1つの戦略は、人工組織がネイティブ組織14,15のそれを模した繊維アライメントを有するように、細胞圧縮から発生する繊維アライメントパターンを制御することを含む。このようなアライメントは、人工組織がネイティブ組織の複雑な機械的挙動を複製するために必要と考えられる。この戦略の修正は、コラーゲンゲルをフィブリンゲル16に置換することです。フィブリンゲルは、圧縮時にコラーゲンゲルと同様のアライメントパターンを発現する。時間が経つにつれて、フィブリンは分解され、初期のフィブリン繊維アライメントパターンに従う細胞合成ECMに置き換えられます。得られた工学的構造は、コラーゲンゲル由来の構築物17と比較して有意に改善された機械的特性を有する。
フィブリンゲルにおけるアライメントプロセスとその後のリモデリングイベントは、複雑で理解が不十分な方法で進行します。これらの相互作用と細胞挙動とECMリモデリングへの影響をより良く特徴付けるために、我々は、外植法に基づく手順を開発した。この方法では、線維芽細胞の外植は、異なる幾何学的パターンでフィブリンゲル上に配置される。ゲルは、環境制御された顕微鏡実装型バイオリアクター18に維持され、圧縮および繊維再調整のプロセスは、タイムラプス差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡で監視される。変位フィールドはカスタムアルゴリズムで定量化されます。これらの実験から得られたデータは、組織工学戦略の最適化、創傷治癒の改善、病理学的組織リモデリングの治療など、多くのプロセスに大きな影響を及ぼします。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、細胞介在ECMリモデリングに関与する力学を観察し、定量化することを目的として開発されました。このようなプロセスは、多くの生物現象の根源であり、工学組織2,22に重要な意味を持ち、瘢痕1,23を減少させ、病理学的組織改修を理解する12,24。タイムラプスDIC顕微鏡を使用することで、細胞牽引力の結果として生じるフィブリン繊維の変位と位置…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョージ・ジュディスとスティーブン・エリアソンは、ヒトの真皮線維芽細胞とラメシュ・ラグパシーに株追跡アルゴリズムの助けを寄付してくれたことに感謝します。この作業の支援は、米国教育省の国家支援フェローシップ(GAANN P200A120071)の大学院支援によって提供されました。
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
Referências
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