Observere og kvantifisere Fibroblast-mediert Fibrin Gel Compaction

Summary

Tidsforløpmikroskopi- og bildebehandlingsteknikker ble brukt til å observere og analysere fibroblastmediert gelkomprimering og fibrinfiberomstilling i en miljøkontrollert bioreaktor over en 48 timers periode.

Abstract

Celler innebygd i kollagen og fibringeler festes og utøver trekkraftkrefter på gelens fibre. Disse kreftene kan føre til lokal og global omorganisering og omstilling av gelmikrostrukturen. Denne prosessen fortsetter på en kompleks måte som delvis er avhengig av samspillet mellom plasseringen av cellene, gelens geometri og de mekaniske begrensningene på gelen. For bedre å forstå hvordan disse variablene produserer globale fiberjusteringsmønstre, bruker vi dic-mikroskopi (time-lapse differensialinterferenskontrast) kombinert med en miljøkontrollert bioreaktor for å observere komprimeringsprosessen mellom geometrisk fordelte utvisninger (klynger av fibroblaster). Bildene analyseres deretter med en tilpasset bildebehandlingsalgoritme for å få kart over belastningen. Informasjonen hentet fra denne teknikken kan brukes til å sondere mekanobiologien til ulike cellematriseinteraksjoner, som har viktige implikasjoner for å forstå prosesser i sårheling, sykdomsutvikling og vevsteknikk.

Introduction

Et viktig verktøy for å studere cellematrise interaksjoner er cellen befolket kollagen gel^1,2. Gelen gir et 3D-miljø som er nærmere vevets in vivo-karakter og bedre egnet for å forstå celleadferd enn det som tilbys av tradisjonelle 2D-kulturer³. Tidlige studier der fibroblaster ble homogent fordelt i en kollagengel, fant at cellene raskt konsoliderer kollagenfibrene og komprimerer gelen^4,5. De sammentrekningsfibroblaster i frie flytende geler går deretter over til en passiv tilstand kort tid etter at gelen har nådd^{komprimering 1,6,7}. Fibroblaster i geler som er begrenset ved grensene forblir i en aktiv, syntetisk tilstand^8, og de genererer fiberjustering på en måte som er avhengig av gelgeometri og eksterne begrensninger^5,9. Forskjeller i celleaktivitet ser ut til å være et resultat av den indre spenningen (eller mangelen på det) som utvikler seg når cellene utøver trekkraftkrefter via integriner på kollagenfibrene i gelen.

En variant av denne teknikken innebærer å plassere fibroblastutløp(dvs. klumper av celler) en avstand fra hverandre i en kollagengel og observere cellematriseinteraksjoner og den gradvise utviklingen av fiberjustering mellom utløpsvirkningene (noen ganger kalt ligamentlignende stropper)^10-12. Den primære fordelen med explant-systemet er at det gjør det mulig å ordne cellene i enkle geometriske mønstre, noe som gjør det lettere å visualisere og sondere mekanismene som ligger til grunn for celledrevet fiberomstilling. Disse justeringsmønstrene – som hovedsakelig er avhengige av samspillet mellom celletraksjonskrefter, cellespatial distribusjon, gelgeometri og de mekaniske begrensningene på gelen – er viktige å forstå fordi de spiller en sentral rolle i global vevsorganisasjon, mekanisk funksjon og lokalt mekanisk miljø¹³.

Innen vevsteknikk innebærer en strategi for å produsere mekanisk funksjonelle, konstruerte vev å kontrollere fiberjusteringsmønsteret som utvikler seg fra cellekomprimering slik at det konstruerte vevet har fiberjustering som etterligner det opprinnelige vevet^14,15. Slik justering antas nødvendig for konstruert vev for å gjenskape den komplekse mekaniske oppførselen til innfødte vev. En modifikasjon av denne strategien er å erstatte kollagengelen med en fibringel¹⁶. Fibringelen utvikler et lignende justeringsmønster som en kollagengel under komprimering. Over tid blir fibrin degradert og erstattet med cellesyntetisert ECM som følger det første fibrin fiberjusteringsmønsteret. Den resulterende konstruerte konstruksjonen har betydelig forbedret mekaniske egenskaper sammenlignet med kollagengelavledede konstruksjoner¹⁷.

Justeringsprosessen og påfølgende ombyggingshendelser i fibringeler fortsetter på en komplisert og dårlig forstått måte. For bedre å karakterisere disse interaksjonene og deres effekt på celleatferd og ECM-ombygging, har vi utviklet en prosedyre som er basert på explant-metoden. I denne metoden er fibroblastutløp plassert på en fibringel i forskjellige geometriske mønstre. Gelene opprettholdes i en miljøkontrollert, mikroskopmontert bioreaktor¹⁸, og prosessen med komprimering og fiberomstilling overvåkes med DIC-mikroskopisk differensialinterferenskontrast (DIC) mikroskopi. Forskyvningsfelt kvantifiseres med egendefinerte algoritmer. Dataene fra disse eksperimentene har omfattende implikasjoner for en rekke prosesser, inkludert optimalisering av vevsteknikkstrategier, forbedring av sårheling og behandling av patologisk vevsoppussing.

Protocol

1. Klargjøring av sjablong Klargjør en sjablong på Parafilm for å utforme plasseringen av hver utvisning, etter ønsket geometri (Figur 1A og 1B). Avstand hver utvisende ca 1-2 mm fra hverandre. Denne avstanden tilsvarer en ideell avstand for å generere fiberjustering mellom uttømmere. Fest sjablongen under området på dekselglasset der prøven skal tilberedes med tape. 2. Sterilisering <p class="jove_content…

Representative Results

Vevsoppussing er en kompleks prosess som delvis drives av gjensidige fysiske interaksjoner mellom celler og den omkringliggende matrisen. Cellene omorganiserer de omkringliggende fibrene og genererer spenning i fibernettverket. Justeringen av fibre og mekanisk miljø styrer i sin tur celleadferd, slik at både celler og matrise globalt omorganiseres for å produsere ombygd vev. I dette eksperimentet begynte cellene i explants, først runde i morfologi, å strekke seg inn i gelen og holde seg til fibrinfibrene (fi…

Discussion

Denne protokollen ble utviklet med det formål å observere og kvantifisere mekanikken som er involvert i cellemediert ECM-ombygging. Slike prosesser ligger til grunn for en rekke biologiske fenomener og har viktige implikasjoner for ingeniørvev^2,22, redusere arr^1,23, og forstå patologisk vev ombygging^12,24. Bruken av tidsforløp DIC mikroskopi gjør det mulig å løse og kvantifisere forskyvning og justering av fibrinfibre som oppstår som følge av celle trekkraft krefter. Omorganiser…

Materials

Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65