Fibroblast aracılı Fibrin Jel Sıkıştırmayı Gözlemleme ve Ölçme
Summary
48 saatlik bir süre boyunca çevre kontrollü bir biyoreaktörde fibroblast aracılı jel sıkıştırma ve fibrin fiber yeniden hizalamayı gözlemlemek ve analiz etmek için zaman atlamalı mikroskopi ve görüntü işleme teknikleri kullanılmıştır.
Abstract
Kollajen ve fibrin jellerine gömülü hücreler jelin liflerine tüze gücü talar ve uygular. Bu kuvvetler jel mikro yapısının yerel ve küresel olarak yeniden düzenlenmesine ve yeniden düzenlenmesine yol açabilir. Bu işlem, kısmen hücrelerin konumu, jelin geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı karmaşık bir şekilde ilerler. Bu değişkenlerin küresel fiber hizalama desenlerini nasıl ürettiğini daha iyi anlamak için, geometrik aralıklı eksplantlar (fibroblast kümeleri) arasındaki sıkıştırma sürecini gözlemlemek için çevre kontrollü bir biyoreaktör ile birlikte zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi kullanıyoruz. Görüntüler daha sonra gerinim haritalarını elde etmek için özel bir görüntü işleme algoritması ile analiz edilir. Bu teknikten elde edilen bilgiler, yara iyileşmesi, hastalık gelişimi ve doku mühendisliği uygulamalarındaki süreçleri anlamak için önemli etkileri olan çeşitli hücre matrisi etkileşimlerinin mekanobiyolojisini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Hücre matrisi etkileşimlerini incelemek için önemli bir araç hücre doldurulmuş kollajen jel1,2. Jel, dokunun in vivo karakterine daha yakın ve hücre davranışını anlamak için geleneksel 2D kültürleri tarafından sunulandan daha uygun bir3Dortam sağlar 3 . Fibroblastların bir kollajen jel içinde homojen bir şekilde dağıtıldığı ilk çalışmalar, hücrelerin kollajen liflerini hızla birleştirdiğini ve jeli kompakt hale geldiğini buldu4,5. Serbest yüzen jellerdeki kontrtil fibroblastlar, jel tamamen sıkıştırmaya ulaştıktan kısa bir süre sonra sessiz bir duruma geçiş1,6,7. Sınırlarda kısıtlanan jellerdeki fibroblastlar aktif, sentetik bir durumda kalır8 ve jel geometrisine ve dış kısıtlamalara bağlı bir şekilde fiber hizalama oluştururlar5,9. Hücre aktiviteslerindeki farklılıklar, hücrelerin jeldeki kolajen lifleri üzerindeki integrinler yoluyla çekiş kuvveti uygulamasıyla gelişen iç gerilimin (veya eksikliğinin) bir sonucu olarak görünmektedir.
Bu tekniğin bir varyantı, fibroblast eksplantlarının(yani hücre kümelerinin) bir kollajen jel içinde birbirinden uzak bir mesafe yerleştirilmesini ve hücre matrisi etkileşimlerini ve eksplantlar (bazen bağ benzeri kayışlar olarak adlandırılır) arasındaki lif hizalamasının kademeli gelişimini gözlemlemeyi içerir10-12. Eksplant sisteminin birincil avantajı, hücreleri basit geometrik desenler halinde düzenlemesine izin vermesidir, bu da hücre güdümlü fiber yeniden hizalamanın altında bulunan mekanizmaları görselleştirmeyi ve araştırmayı kolaylaştırır. Öncelikle hücre çekiş kuvvetleri, hücre mekansal dağılımı, jel geometrisi ve jel üzerindeki mekanik kısıtlamalar arasındaki etkileşime bağlı olan bu hizalama kalıplarının anlaşılması önemlidir, çünkü küresel doku organizasyonunda, mekanik işlevde ve yerel mekanik ortamda merkezi bir rol oynarlar13.
Doku mühendisliği alanında, mekanik olarak işlevsel, mühendislik dokuları üretmek için bir strateji, hücre sıkıştırmasından gelişen lif hizalama deseninin kontrol edilmesidir, böylece mühendislik dokusu yerel dokununkini taklit eden lif hizalamaya sahiptir14,15. Bu hizalamanın, tasarlanmış dokuların yerli dokuların karmaşık mekanik davranışlarını çoğaltması için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Bu stratejinin bir modifikasyonu kollajen jelini bir fibrin jeli ile değiştirmektir16. Fibrin jeli, sıkıştırma sırasında kollajen jel ile benzer bir hizalama deseni geliştirir. Zamanla fibrin bozulur ve ilk fibrin lif hizalama desenini izleyen hücre sentezlenmiş ECM ile değiştirilir. Elde edilen mühendislik yapısı, kollajen jel türetilmiş yapılara kıyasla önemli ölçüde geliştirilmiş mekanik özelliklere sahiptir17.
Fibrin jellerindeki hizalama işlemi ve sonraki yeniden şekillendirme olayları karmaşık ve kötü anlaşılmış bir şekilde ilerler. Bu etkileşimleri ve bunların hücre davranışı ve ECM tadilatı üzerindeki etkilerini daha iyi karakterize etmek için explant yöntemine dayanan bir prosedür geliştirdik. Bu yöntemde fibroblast eksplantları farklı geometrik desenlerde bir fibrin jeli üzerine yerleştirilmiştir. Jeller çevre kontrollü, mikroskop monteli biyoreaktör18’detutulur ve sıkıştırma ve fiber yeniden hizalama işlemi zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskopisi ile izlenir. Öteleme alanları özel algoritmalarla ölçülür. Bu deneylerden elde edilen veriler, doku mühendisliği stratejilerini optimize etmek, yara iyileşmesini iyileştirmek ve patolojik doku tadilatını tedavi etmek de dahil olmak üzere bir dizi süreç için geniş kapsamlı etkilere sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, hücre aracılı ECM tadilatında yer alan mekaniği gözlemlemek ve ölçmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu tür süreçler bir dizi biyolojik fenomenin altında yatan ve mühendislik dokuları için önemli etkileri olan2,22, yara izini1,23azaltarak ve patolojik doku tadilatını anlamak12,24. Zaman atlamalı DIC mikroskopisi kullanımı, hücre çekiş kuvvetlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkan fibrin liflerinin yer değiştirmesini ve hizalamasını çözmesini ve ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
George Giudice ve Steven Eliason’a insan dermal fibroblastları ve Ramesh Raghupathy’yi gerinim izleme algoritmasına yardım için bağışlayarak teşekkür ederiz. Bu çalışma için destek, ABD Eğitim Bakanlığı Lisansüstü Yardım Ulusal İhtiyaç Bursu Alanlarında (GAANN P200A120071) tarafındansağlanmıştır.
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
Referências
- Grinnell, F., Petroll WM, . Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. . Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , (2008).
- Pedersen JA, ., Swartz MA, . Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, . Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS, ., Robinson PS, . Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY, ., Sulli van KE, ., Black LD, . Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS, ., Zahalak GI, ., Elson EL, . Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
