Nous décrivons ici une procédure pour imager des complexes viraux dans un liquide à une résolution nanométrique à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
Les chercheurs utilisent régulièrement des microscopes électroniques à transmission (TEMs) pour examiner des entités biologiques et évaluer de nouveaux matériaux. Ici, nous décrivons une application supplémentaire pour ces instruments: la visualisation d’assemblages viraux dans un environnement liquide. Cette méthode passionnante et nouvelle de visualisation des structures biologiques utilise un porte-spécimen à base de microfluidique récemment développé. Notre article vidéo montre comment assembler et utiliser un support microfluidique pour imager des spécimens liquides dans un TEM. En particulier, nous utilisons des particules à double couche (DLP) du rotavirus simien comme système modèle. Nous décrivons également les étapes pour recouvrir la surface de la chambre liquide de biofilms d’affinité qui attachent les DLP à la fenêtre de visualisation. Cela nous permet d’imager les assemblages d’une manière adaptée à la détermination de la structure 3D. Ainsi, nous présentons un premier aperçu des particules subvirales dans un environnement liquide natif.
Un objectif commun des biologistes et des ingénieurs est de comprendre le fonctionnement interne des machines moléculaires. Les microscopes électroniques à transmission (TEMs) sont des instruments idéaux pour visualiser ces détails complexes à une résolution quasi atomique1-2. Afin de soutenir le système à vide poussé d’un TEM, les échantillons biologiques sont typiquement encastrés dans des films minces de glace vitreuse3,de sucres4,de sels de métaux lourds5,ou d’une combinaison de ceux-ci6. Par conséquent, les images d’échantillons incorporés peuvent ne révéler que des instantanés limités de processus dynamiques.
Des tentatives précoces pour maintenir les spécimens biologiques hydratés dans des chambres liquides environnementales ont été entreprises par Parsons et collègues utilisant des étapes de pompage différentielles. Des modèles de diffraction d’électrons de cristaux de catalase non souillés ont été enregistrés avec succès à une résolution de 3 Å dans un état hydraté7-8. En outre, des domaines lipidiques séparés en phase ont pu être examinés dans des membranes hydratées d’érythrocytes humains9-10. Cependant, le mouvement causé par la diffusion du liquide et son interférence avec le faisceau d’électrons, a entraîné une perte de résolution grave et d’autres expériences utilisant des échantillons biologiques n’ont pas été tentées jusqu’à récemment.
De nouveaux supports d’échantillons microfluidiques ont été introduits qui utilisent des micropuces semi-conductrices pour former une chambre environnementale micro-échelle. Ces dispositifs peuvent maintenir les échantillons dans un liquide pendant qu’ils sont positionnés dans une colonne TEM11-12. Cette percée technique dans l’imagerie TEM a permis aux chercheurs de visualiser, pour la première fois, des événements progressifs au niveau moléculaire13. Nous appelons cette nouvelle modalité « microscopie moléculairein situ » car les expériences peuvent maintenant être effectuées « à l’intérieur » de la colonne EM14-15. L’objectif global de cette méthode est d’imager les assemblages biologiques dans un liquide afin d’observer leurs comportements dynamiques à une résolution nanométrique. La raison d’être de la technique mise au point est d’enregistrer les observations en temps réel et d’examiner les nouvelles propriétés des machines biologiques en solution. Cette méthodologie élargit l’utilisation des TEMs à des fins plus larges en biologie cellulaire et moléculaire12-16.
Dans l’article vidéo actuel, nous présentons un protocole complet pour assembler et utiliser un support d’échantillon microfluidique disponible dans le commerce. Ces supports spécialisés utilisent des micropuces de nitrure de silicium produites avec des entretoises intégrées pour former une chambre liquide qui renferme des volumes infimes de solution. Des fenêtres minces et transparentes sont gravées dans les micropuces à des fins d’imagerie12. Nous démontrons l’utilisation appropriée d’un support microfluidique pour examiner les particules à double couche (DLPs) du rotavirus simien dans un liquide à l’aide d’une TEM. Pour s’assurer que les assemblages biologiques, tels que les DLP, ne diffusent pas rapidement sur de grandes distances lors de l’imagerie, nous utilisons l’approche Affinity Capture pour les attacher à la surface de la chambre microfluidique16. Cette étape de capture moléculaire présente un avantage majeur par rapport aux techniques alternatives d’imagerie des échantillons biologiques dans un liquide, car elle permet l’acquisition d’images qui seront utilisées pour les routines de traitement en aval. Cette étape de capture utilisée en conjonction avec l’imagerie microfluidique est unique à nos procédures17. Les lecteurs qui utilisent des applications de biologie structurale à l’aide de la TEM ou de chambres d’imagerie microfluidiques peuvent envisager l’utilisation de techniques de capture d’affinité lorsque les observations dynamiques au niveau moléculaire sont l’objectif final.
Dans notre travail présenté, nous avons employé l’approche de capture d’affinité pour attacher le rotavirus DLPs à une plate-forme microfluidique. Cela a permis l’imagerie in situ de complexes macromoléculaires dans un microenvironnement liquide. L’approche de capture est importante en ce qui concerne d’autres techniques d’imagerie microfluidique, car elle localise les échantillons biologiques dans la fenêtre d’imagerie pour annuler les grands problèmes diffusifs qui survie…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le Dr Michael J. Friedlander, directeur du Virginia Tech Carilion Research Institute, d’avoir encouragé nos efforts de recherche. Ce projet a été soutenu par des fonds de développement de S.M.M et D.F.K. et en partie par l’initiative Nano-Bio de l’Institute for Critical Technology and Applied Science de Virginia Tech.
E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
Equipment | |||
Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |