In situ TEM der biologischen Baugruppen in Flüssig

Summary

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Abbildung viraler Komplexe in Flüssigkeit in Nanometerauflösung mit einem Transmissionselektronenmikroskop.

Abstract

Die Forscher verwenden regelmäßig Transmission Electron Microscopes (TEMs), um biologische Einheiten zu untersuchen und neue Materialien zu bewerten. Hier beschreiben wir eine zusätzliche Anwendung für diese Instrumente – die Anzeige viraler Baugruppen in einer flüssigen Umgebung. Diese spannende und neuartige Methode zur Visualisierung biologischer Strukturen nutzt einen kürzlich entwickelten mikrofluidischen Probenhalter. Unser Videoartikel zeigt, wie man einen mikrofluidischen Halter zusammenbaut und verwendet, um flüssige Proben innerhalb eines TEM abzubilden. Insbesondere verwenden wir simian Rotavirus Doppelschichtpartikel (DLPs) als Modellsystem. Wir beschreiben auch Schritte, um die Oberfläche der Flüssigkeitskammer mit Affinitätsbiofilmen zu beschichten, die DLPs an das Sichtfenster ankleben. Dies ermöglicht es uns, Baugruppen so abzubilden, dass sie für die 3D-Strukturbestimmung geeignet sind. So präsentieren wir einen ersten Einblick in subvirale Partikel in einer nativen flüssigen Umgebung.

Introduction

Ein gemeinsames Ziel von Biologen und Ingenieuren ist es, das Innenleben molekularer Maschinen zu verstehen. Transmission Electron Microscopes (TEMs) sind ideale Instrumente, um diese komplizierten Details mit nahezu atomarer Auflösung^1-2zu visualisieren. Um das Hochvakuumsystem eines TEM aufrecht zu erhalten, sind biologische Proben typischerweise in dünne Folien aus Glaseis³, Zucker⁴, Schwermetallsalze⁵oder eine Kombination davon⁶eingebettet. Daher können Bilder eingebetteter Proben nur begrenzte Momentaufnahmen dynamischer Prozesse zeigen.

Erste Versuche, biologische Proben in Flüssigkammern der Umwelt hydratisiert zu halten, wurden von Parsons und Kollegen mit Differentialpumpstufen unternommen. Elektronenbeugungsmuster von ungefärbten Kataalasekristallen wurden erfolgreich mit einer Auflösung von 3 ° in einem hydratisierten Zustand^7-8aufgezeichnet. Darüber hinaus könnten phasengetrennte Lipiddomänen in hydratisierten Membranen menschlicher Erythrozyten^9-10untersucht werden. Bewegungsstörungen durch das Ausstreuen von Flüssigkeit und deren Interferenz mit dem Elektronenstrahl führten jedoch zu einem starken Auflösungsverlust, und weitere Experimente mit biologischen Proben wurden erst vor kurzem versucht.

Neu entwickelte mikrofluidische Probenhalter wurden eingeführt, die Halbleiter-Mikrochips verwenden, um eine mikroskalierte Umweltkammer zu bilden. Diese Geräte können Proben in Flüssigkeit halten, während sie in einer^{TEM-Säule 11-12}positioniert sind. Dieser technische Durchbruch in der TEM-Bildgebung hat es Forschern ermöglicht, zum ersten Mal progressive Ereignisse auf molekularer Ebene¹³zu sehen. Wir bezeichnen diese neue Modalität als“in situ molekulare Mikroskopie”, da Experimente nun “innerhalb” der^{EM-Säule 14-15}durchgeführt werden können. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, biologische Baugruppen in Flüssigkeit abzubilden, um ihr dynamisches Verhalten bei Nanometerauflösung zu beobachten. Der Grund gedanke hinter der entwickelten Technik ist es, Echtzeitbeobachtungen aufzuzeichnen und neue Eigenschaften biologischer Maschinen in Lösung zu untersuchen. Diese Methode erweitert die Verwendung von TEMs für breitere Zwecke in der Zell- und Molekularbiologie^12-16.

Im aktuellen Videoartikel stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Montage und Verwendung eines handelsüblichen mikrofluidischen Probenhalters vor. Diese spezialisierten Halter verwenden Siliziumnitrid-Mikrochips, die mit integrierten Abstandshaltern hergestellt werden, um eine flüssige Kammer zu bilden, die winzige Lösungsvolumina umschließt. Dünne, transparente Fenster werden zu Bildgebungszwecken in die Mikrochips eingeätzt¹². Wir zeigen die ordnungsgemäße Verwendung eines mikrofluidischen Halters zur Untersuchung von simianrotavirus double-layered particles (DLPs) in Flüssigkeit mit einem TEM. Um sicherzustellen, dass biologische Baugruppen, wie z. B. DLPs, während der Bildgebung nicht schnell über große Entfernungen diffundieren, verwenden wir den Affinity Capture-Ansatz, um sie an die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer¹⁶zu fesseln. Dieser molekulare Erfassungsschritt hat einen großen Vorteil gegenüber alternativen Verfahren zur Abbildung biologischer Proben in Flüssigkeit, da er die Erfassung von Bildern ermöglicht, die für nachgelagerte Verarbeitungsroutinen verwendet werden. Dieser Erfassungsschritt in Verbindung mit mikrofluidischer Bildgebung ist einzigartig in unseren Verfahren¹⁷. Leser, die strukturbiologische Anwendungen mit TEM oder mikrofluidischen Bildgebungskammern verwenden, können den Einsatz von Affinitätserfassungstechniken in Betracht ziehen, wenn dynamische Beobachtungen auf molekularer Ebene das Endziel sind.

Protocol

1. Vorbereiten von Affinity Capture-Geräten16 Reinigen Sie die Siliziumnitrid-E-Chips, indem Sie sie in 15 ml Aceton für 2 min, gefolgt von 15 ml Methanol für 2 min(Abbildung 1A). Lassen Sie Diesunter laminarem Luftstrom trocknen. Die getrockneten Späne auf einer erhitzten Rührplatte (ohne Rühren) 1,5 Stunden bei 150 °C inkubieren und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Verwenden Sie Hamilton-Spritzen, um Lipi…

Representative Results

Repräsentative Bilder von DLPs in Flüssigkeit mit E-Chips, die glühend entladen wurden (Abbildung 3A) zeigen weniger DLPs in einem bestimmten Betrachtungsbereich, vermutlich aufgrund der Diffusion, im Vergleich zu DLPs, die auf Affinity Capture-Geräten angereichert sind (Abbildung 3B). Die Zugabe von Uranylformat in der Bildkammer erhöht den Kontrast der Probe und damit die Sichtbarkeit einzelner DLPs in Lösung(Abbildung 3C, oberes Panel). Ein besserer Kontrast erm…

Discussion

In unserer vorgestellten Arbeit haben wir den Affinitätserfassungsansatz verwendet, um dlPs mit Rotavirus auf eine mikrofluidische Plattform zu bringen. Dies ermöglichte die In-situ-Bildgebung makromolekularer Komplexe in einer flüssigen Mikroumgebung. Der Erfassungsansatz ist im Vergleich zu anderen mikrofluidischen Bildgebungsverfahren von Bedeutung, da er biologische Proben in das Bildgebungsfenster lokalisiert, um große diffusive Probleme zu negieren, die bei der Aufnahme von Bildern in F…

Materials

E-chips, spacer chip	Protochips, Inc.	EPB-52TBD	400 μm x 50 μm window
E-chip, top chip	Protochips, Inc.	EPT-45W	400 μm x 50 μm window
Ni-NTA lipid	Avanti Polar Lipids	790404P	Powder form
DLPC (12:0) lipid	Avanti Polar Lipids	850335P	Powder form
Volumetric flasks	Fisher Scientific	20-812A; 20-812C	1 ml; 5 ml
Hamilton Syringes	Hamilton Co.	80300, 80400	1-10 μl; 1-25 μl
Whatman #1 filter paper	Whatman	1001 090	100 pieces, 90 mm
Glass Petri dishes	Corning	70165-101	100 mm x 15 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	14673-010	14673-010
Glass culture tubes	VWR	47729-566	6 mm x 50 mm
Acetone	Fisher Scientific	A11-1	1 L
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	1 L
Chloroform	Electron Microcopy Sciences	12550	100 ml
His-tagged Protein A	Abcam, Inc.	ab52953	10 mg
Milli-Q water system	EMD Millipore Corp.	Z00QSV001	Ultrapure Water
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	500 g
Equipment
Poseidon In situ specimen holder	Protochips, Inc.		FEI compatible
FEI Spirit BioTwin TEM	FEI Co.		120 kV
Eagle 2k HS CCD camera	FEI Co.		10 Å/pixel sampling at 30,000X
Gatan 655 Dry pump station	Gatan, Inc.		Pump holder tip to 10-6 range
PELCO easiGlow, glow discharge unit	Ted Pella, Inc.		Negative polarity mode
Isotemp heated stir plate	Fisher Scientific		Heat to 150 ºC for 1.5 hr