시투에서 액체에 있는 생물학 어셈블리의 TEM
Summary
여기서는 투과 전자 현미경을 이용하여 나노미터 해상도로 액체에 바이러스 성 복합체를 이미지화하는 절차를 설명합니다.
Abstract
연구원은 정기적으로 전염 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 생물학적 개체를 검사하고 새로운 물질을 평가합니다. 여기서는 액체 환경에서 이러한 계측기-바이러스 성 어셈블리를 볼 수 있는 추가 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 생물학적 구조를 시각화하는 이 흥미롭고 새로운 방법은 최근에 개발된 미세 유체 기반 표본 홀더를 활용합니다. 비디오 기사에서는 미세 유체 홀더를 조립하고 사용하여 TEM 내에서 액체 표본을 이미지화하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 우리는 우리의 모델 시스템으로 시미안 로타 바이러스 이중 층 입자 (DlP)를 사용합니다. 우리는 또한 보기 창에 DLP를 묶는 친화성 생물막으로 액체 챔버의 표면을 코팅하는 단계를 설명합니다. 이렇게 하면 3D 구조 결정에 적합한 방식으로 어셈블리를 이미지할 수 있습니다. 따라서, 우리는 네이티브 액체 환경에서 서브 바이러스 입자의 첫 번째 엿볼을 제시한다.
Introduction
생물학자와 엔지니어의 공통된 목표는 분자 기계의 내부 작동을 이해하는 것입니다. 전송 전자 현미경 (TEM)은 거의 원자 해상도1-2에서이러한 복잡한 세부 사항을 시각화하기에 이상적인 도구입니다. TEM의 높은 진공 시스템을 유지하기 위해, 생물학적 샘플은 전형적으로 유리체3,설탕4,중금속 염5,또는 그일부조합6의 박막에 내장되어 있다. 따라서 임베디드 표본의 이미지는 동적 프로세스의 제한된 스냅샷만 나타낼 수 있습니다.
환경 액체 챔버에서 수화 된 생물학적 표본을 유지하기 위한 초기 시도는 파슨스와 동료들이 차동 펌핑 단계를 사용하여 수행되었습니다. 스테인드 카탈라제 결정의 전자 회절 패턴은7-8수화 상태에서 3Å의 해상도로 성공적으로 기록되었다. 또한, 위상 분리지질 도메인은 인간 적혈구9-10의수화 막에서 검사될 수 있었다. 그러나, 액체를 확산시키고 전자빔과의 간섭으로 인한 움직임은, 생물학적 표본을 이용한 심한 분해능 손실 및 추가 실험이 최근까지 시도되지 않았다.
새로 개발된 미세유체 표본 홀더는 반도체 마이크로칩을 활용하여 마이크로 스케일환경챔버를 형성하는 것으로 소개되었습니다. 이러한 장치는 TEM 컬럼11-12에위치하는 동안 액체로 샘플을 유지할 수 있습니다. TEM 이미징의 이러한 기술적 돌파구는 연구자들이 분자 수준13에서처음으로 진보적인 사건을 볼 수 있게 해 주어 왔다. 우리는 실험이 이제 EM 컬럼14-15를“내부”수행 할 수 있으므로“시투 분자 현미경 검사법에서”로이 새로운 양식도를 지칭한다. 이 방법의 전반적인 목표는 나노미터 해상도에서 그들의 동적 행동을 관찰하기 위하여 액체에 있는 생물학 어셈블리를 심상하는 것입니다. 개발 된 기술의 근거는 실시간 관찰을 기록하고 용액에서 생물학적 기계의 새로운 특성을 검사하는 것입니다. 이 방법론은 세포 및 분자 생물학12-16에서더 넓은 목적을 위해 TEM의 사용을 확장합니다.
현재 비디오 문서에서는 시판되는 미세 유체 표본 홀더를 조립하고 사용하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 전문 홀더는 통합 스페이서로 생성된 실리콘 트랜티드 마이크로칩을 사용하여 미세량의 용액을 둘러싸는 액체 챔버를 형성합니다. 얇고 투명한 창문은 이미징 목적을 위해 마이크로칩에 새겨져있다(12). 우리는 TEM을 사용하여 액체에 있는 simian rotavirus 이중 층 입자 (DlPs)를 검사하기 위하여 미세 유체 홀더의 적당한 사용을 보여줍니다. DP와 같은 생물학적 어셈블리가 이미징 하는 동안 먼 거리에서 빠르게 확산되지 않도록 하기 위해, 우리는 미세 유체챔버(16)의표면에 그들을 묶기 위해 선호도 캡처 접근법을 채택한다. 이 분자 포획 단계는 다운스트림 처리 루틴에 사용될 이미지의 수집을 허용하기 때문에 액체에서 생물학적 표본을 이미징하기위한 대체 기술에 비해 주요 이점이 있습니다. 미세 유체 이미징과 함께 사용되는 이 캡처 단계는 당사의절차(17)에고유합니다. TEM 또는 미세 유체 이미징 챔버를 사용하여 구조 생물학 응용 프로그램을 사용하는 독자는 분자 수준에서 동적 관찰이 최종 목표일 때 친화성 캡처 기술의 사용을 고려할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 작업에서, 우리는 마이크로 유체 플랫폼에 밧줄 로타 바이러스 DLP에 친화성 캡처 접근 방식을 채택했다. 이것은 액체 미세 환경에서 매크로 분자 복합체의 시상 화상 진찰에서 허용했습니다. 포획 접근법은 다른 미세 유체 이미징 기술과 관련하여 중요한데, 이는 액체에서 이미지를 기록하는 동안 발생하는 큰 확산 문제를 부정하기 위해 이미징 창에 생물학적 표본을 국…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우리의 연구 노력을 장려하기위한 버지니아 기술 캐릴리온 연구소의 이사 마이클 J. 프리들랜더 박사를 인정합니다. 이 프로젝트는 S.M.M 및 D.F.K.에 대한 개발 기금에 의해 지원되었으며 버지니아 공대의 중요 기술 및 응용 과학 연구소의 나노 바이오 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
Referências
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
