Yerinde Sıvıda Biyolojik Montajlar TEM
Summary
Burada, viral kompleksleri bir iletim elektron mikroskobu kullanarak nanometre çözünürlüğünde sıvı olarak görüntüleme prosedürünü açıklıyoruz.
Abstract
Araştırmacılar, biyolojik varlıkları incelemek ve yeni malzemeleri değerlendirmek için düzenli olarak İletim Elektron Mikroskoplarını (TEM’ ler) kullanırlar. Burada, bu aletler için ek bir uygulama açıklıyoruz – viral montajları sıvı bir ortamda görüntülemek. Biyolojik yapıları görselleştirmenin bu heyecan verici ve yeni yöntemi, yakın zamanda geliştirilen mikroakışkan bazlı bir numune tutucuyu kullanır. Video makalemiz, bir TEM içindeki sıvı örnekleri görüntülemek için bir mikroakışkan tutucunun nasıl birleştirılacağını ve kullanılacağını göstermektedir. Özellikle simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLP’ ler) model sistemimiz olarak kullanıyoruz. Ayrıca, sıvı odasının yüzeyini GÖRÜNTÜLEME penceresine DLP’leri bağlayan benzeşim biyofilmleri ile kaplama adımlarını da açıklıyoruz. Bu, montajları 3D yapı belirlemeye uygun bir şekilde görüntü oluşturmamızı sağlar. Böylece, doğal bir sıvı ortamda subviral parçacıkların ilk bakışını sunuyoruz.
Introduction
Biyologların ve mühendislerin ortak amacı moleküler makinelerin iç işleyişini anlamaktır. İletim Elektron Mikroskopları (TEM’ler), bu karmaşık ayrıntıları atoma yakın çözünürlük1-2’degörselleştirmek için ideal araçlardır. Bir TEM’in yüksek vakum sistemini sürdürmek için, biyolojik numuneler tipik olarak vitreus buz 3 ,şekerler4,ağır metal tuzları5veya6’nınbir kombinasyonunun ince filmlerine gömülür. Sonuç olarak, gömülü örneklerin görüntüleri dinamik süreçlerin yalnızca sınırlı anlık görüntülerini ortaya çıkabilir.
Çevresel sıvı odalarında nemlendirilmiş biyolojik örneklerin korunması için erken girişimler Parsons ve meslektaşları tarafından diferansiyel pompalama aşamaları kullanılarak gerçekleştirilendir. Lekesiz katalaz kristallerinin elektron kırınım desenleri, hidratlı bir durumda 3 şçözünürlüğe başarıyla kaydedildi7-8. Ek olarak, faza ayrılmış lipit alanları insan eritrositlerinin hidratlı zarlarında incelenebilir9-10. Bununla birlikte, sıvının yayılmasından ve elektron ışınlarına müdahalesinden kaynaklanan hareket, ciddi çözünürlük kaybına neden oldu ve yakın zamana kadar biyolojik örnekler kullanılarak daha fazla deney yapılmaya çalışılamamıştır.
Mikro ölçekli bir çevre odası oluşturmak için yarı iletken mikroçipleri kullanan yeni geliştirilen mikroakışkan numune tutucular tanıtıldı. Bu cihazlar, numuneleri bir TEM sütunu11-12’yeyerleştirilmişken sıvı halde muhafaza edebilir. TEM görüntülemedeki bu teknik atılım, araştırmacıların ilk kez moleküler düzeydeki ilerici olayları görüntülemelerini sağladı13. Deneyler artık EM sütunu14-15içinde gerçekleştirilebildiği için bu yeni modaliteyi“yerinde moleküler mikroskopi” olarak adlandırıyoruz. Bu yöntemin genel amacı, nanometre çözünürlüğünde dinamik davranışlarını gözlemlemek için biyolojik montajları sıvı içinde görüntülemektedir. Geliştirilen tekniğin arkasındaki mantık, gerçek zamanlı gözlemleri kaydetmek ve biyolojik makinelerin yeni özelliklerini çözümde incelemektir. Bu metodoloji, hücresel ve moleküler biyolojide daha geniş amaçlar için TEM kullanımını genişletir12-16.
Mevcut video makalesinde, piyasada bulunan bir mikroakışkan numune tutucuyu birleştirmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu özel tutucular, dakika hacimlerini içeren bir sıvı odası oluşturmak için entegre aralayıcılarla üretilen silikon nitrür mikroçiplerini kullanır. İnce, şeffaf pencereler görüntüleme amacıyla mikroçiplere kazınır12. Bir TEM kullanarak sıvıdaki simian rotavirüs çift katmanlı partikülleri (DLL’ler) incelemek için mikroakışkan tutucunun doğru kullanımını gösteriyoruz. DLP’ler gibi biyolojik montajların görüntüleme sırasında büyük mesafelerde hızla yayılmasına izin vermek için, onları mikroakışkan odanın yüzeyine bağlamak için Benzeşim Yakalama yaklaşımını16. Bu moleküler yakalama adımı, biyolojik örneklerin sıvı içinde görüntülenmesi için alternatif tekniklere göre büyük bir avantaja sahiptir, çünkü aşağı akış işleme rutinleri için kullanılacak görüntülerin elde edilmesine izin verir. Mikroakışkan görüntüleme ile birlikte kullanılan bu yakalama adımı prosedürlerimize özgüdür17. TEM veya mikroakışkan görüntüleme odalarını kullanarak yapısal biyoloji uygulamaları kullanan okuyucular, moleküler düzeyde dinamik gözlemler nihai hedef olduğunda benzeşim yakalama tekniklerinin kullanımını düşünebilirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunduğumuz çalışmada, rotavirüs DLP’lerini mikroakışkan bir platforma bağlamaya yönelik benzeşim yakalama yaklaşımını çalıştık. Bu, sıvı bir mikroçevrinde makromoleküler komplekslerin yerinde görüntülenmesini sağladı. Yakalama yaklaşımı, diğer mikroakışkan görüntüleme teknikleri açısından önemlidir, çünkü görüntüleri sıvı olarak kaydederken ortaya çıkan büyük difüzif sorunları reddetmek için biyolojik örnekleri görüntüleme penceresine lok…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Virginia Tech Carilion Araştırma Enstitüsü Direktörü Dr. Michael J. Friedlander’ı araştırma çabalarımızı teşvik etmek için kabul ediyorlar. Bu proje S.M.M ve D.F.K.’ye geliştirme fonları ve kısmen Virginia Tech Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilim Enstitüsü’nün Nano-Bio girişimi tarafından desteklendi.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
Referências
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
