Imaging av sentrosomalt proteiner under Drosophila spermatogenesen er en kraftig metode for å identifisere nye proteiner kritisk for sentrosomen biologi samt å belyse den aktuelle funksjonen kjente aktører i denne prosessen.
Centrosomes er bevart microtubule baserte organeller som struktur og funksjon endres dramatisk gjennom cellesyklus og celledifferensiering. Centrosomes er avgjørende for å bestemme celledeling aksen under mitose og å nucleate flimmerhårene under interfase. Identiteten av de proteiner som formidler disse dynamiske forandringer forblir bare delvis kjent, og funksjonen av mange av de proteiner som er involvert i disse prosesser fremdeles er rudimentær. Nyere arbeider har vist at Drosophila spermatogenesis gir et kraftig system for å identifisere nye proteiner kritisk for sentrosomen funksjon og dannelse samt å få innsikt i den aktuelle funksjonen kjente spillere i sentrosomen relaterte prosesser. Drosophila er en etablert genetisk modellorganisme hvor mutanter i sentrosomalt gener kan lett oppnås og enkelt analysert. Videre, nylige fremskritt i følsomhet og oppløsning av lysmikroskopi ogUtviklingen av robuste genetisk kodede sentrosomalt markører har endret evne til å bruke Drosophila testes som en enkel og tilgjengelig modellsystem for å studere centrosomes. Dette notatet beskriver bruk av genetisk merket sentrosomalt markører for å utføre genetiske skjermer for nye sentrosomalt mutanter og å få innsikt i den spesifikke funksjon av nylig identifiserte gener.
Drosophila testiklene er et egnet organ system for å studere en rekke cellulære og utviklingsprosesser, og har blitt anmeldt omfattende gjennom årene 1-9. Manuskriptet fokuserer på bruk av Drosophila testiklene til å studere sentrosomen, en konservert cellulære organeller. Som i andre systemer, sentrosomen av Drosophila testiklene funksjon i mitose, meiose og ciliogenesis 10.. Centrosomes er sammensatt av et par av microtubule baserte strukturer kjent som Sentrioler omgitt av et komplekst protein nettverk kalt pericentriolar materiale (PCM). Den centriole paret består av en eldre mor centriole og en yngre datter centriole. Som cellen utvikler seg mot mitose, begge Sentrioler skille, duplisere, og skaffe seg en stor mengde PCM til slutt danne to forskjellige centrosomes. Den sentrosomen inneholdende den opprinnelige mor centriole er referert til som moder sentrosomen og centrOSOME inneholder den opprinnelige datter centriole omtales som datter sentrosomen.
Drosophila testiklene er ideelle for å studere de molekylære grunnlaget for sentrosomen biologi av fluorescerende mikroskop for en rekke grunner.
Sammen, de ovennevnte karakteristikkene av Drosophila testikler gir en modell der sentrosomen kan studeres ved enkel, rask og detaljert lydbilde. De teknikker som er beskreveti denne artikkelen har blitt brukt til å undersøke mange aspekter av sentrosomen biologi inkludert centriole formasjon 11, centriole duplisering 15, PCM rekruttering 16, sentrosomen regulering 17, og ciliogenesis 18. Disse teknikkene har også blitt brukt til å studere sentrosomen i andre områder av biologi som meiotisk regulering 19, spindelenheten 20, og sentrosomen aktivitet i asymmetrisk stamcelle divisjon 21 blant mange andre.
Avbildning av testiklene i sentrosomen starter med å skaffe fluer som uttrykker genetisk-merkede sentrosomalt proteiner og isolere testiklene fra mannlige larver, puppe, eller voksne fluer. Disse fluene er tilgjengelig fra flere forskningsgrupper 1,11,15,22-25. Larve testiklene inneholde alle stadier av spermatogenesen før meiose og er nyttige når analysere mutasjoner som er dødelig i puppe eller voksen. Men Late pupal eller unge Adult testiklene er den mest robuste og inneholde alle pre-og post-meiotisk stadier av spermatogenesen, og dermed gjør dem foretrekke for analyse. Siden antall sædceller reduseres når flue aldre, er bruken av voksen testiklene også hensiktsmessig for å studere sentrosomen i sammenheng med aldring. 26. En fremgangsmåte for testis isolert fra voksne fluer tidligere er beskrevet 27.
Imaging av centrosomes og deres funksjon i Drosophila testikler kan oppnås via tre relaterte låter som presenteres her (figur 3). Valg av hvilke spor er mest hensiktsmessig er avhengig av arten av den aktuelle undersøkeren er adressering.
Spor A innebærer avbildning av levende testiklene. Det er den raskeste av de tre sporene, men kan bare brukes når prøvene ikke trenger å bli bevart og når farging er ikke nødvendig. I Track A, er testiklene montert (intakt, gjennomboret eller klippe) på lysbilderog nøye klemt under et dekkglass for å danne et enkelt lag av lett identifiserbare celler. Cellene blir deretter visualisert ved hjelp av både fase-kontrastmikroskopi og fluorescerende mikroskopi. Anvendelse av fase-kontrast er spesielt viktig for analyse av Drosophila testikler, fordi det viser cellulær informasjon som ikke er synlig med andre former for overført lys, og således tillater en rask identifisering av forskjellige faser av utvikling av spermiene 28,29. Imidlertid har Track En to største ulempene. Først er den morfologiske integritet av celler ofte kompromittert når testiklene er sprukket. For det andre, ufestede cellene noen ganger flytte innenfor prøven, noe som gjør den avbildning av flere confocal lag innenfor et angitt område vanskelig. For å fremme en analyse av spesifikke celletyper, kan prøvene bli gjennomboret eller kuttes for å lede veien testis brister slik at squashing under dekkminimalt påvirker morfologien til den celletype av interesse.
Spor B innebærer kjemisk fiksering av testiklene. Dette sporet krever en mellomliggende mengde tid for preparering og har den fordel at faste prøver kan lagres for senere analyse. Videre tjener fiksering for å gjøre cellulære strukturer stivere, noe som reduserer bevegelse av prøven under avbildning. Men blir fasekontrastmikros mye mindre informativ etter kjemisk fiksering, noe som gjør noen stadier av sperm utvikling vanskelig å identifisere.
Track C er den mest tidkrevende, men har den fordelen at cellulære strukturer er faste og immunostained, noe som åpner for visualisering av proteiner som ikke er tilgjengelige med de riktige genetikk koder. Det er mange antistoffer tilgjengelige både kommersielt og fra ulike forskningsmiljøer for farging centrosomes og sentrosomen relaterte strukturer i Drosophila testikler.
Studerer sentrosomen biologi i flue testes ved hjelp av genetisk merkede sentrosomalt markører er en nyttig metode for å vurdere sentrosomen funksjon og aktivitet i både villtype-og mutant sammenheng. Spesielt er Track En egnet for rask screening av sentrosomalt abnormaliteter som misdannelse, misegregation, ustabilitet, eller unormal lengde i et forsøk på å identifisere nye mutanter. Videre spermatid flimmerhårene i live-forberedelser forbli motile for ca 15 min etter disseksjon og bruk av levende testiklene i Track A gir også mulighet for sperm motilitet å være lett adressert. Siden aktiviteten av motile spermier cilia er direkte relatert til sentrosomen funksjon, kan analyser gjennomføres for å bestemme effekten av ulike sentrosomalt mutasjoner på ciliær-funksjon. Spor B kan brukes for mer spesifikke observasjoner, spesielt når statistiske data er nødvendig for eksempel for å telle antall Sentrioler per celle og eller antall celler pr cyste. Track C er mest useful for detaljerte observasjoner som krever farging med antistoffer. Eksempler innbefatter merking av en bestemt celletype, for eksempel stamceller, farging av et protein som ikke har et tilgjengelig kode, for eksempel acetylert tubulin, eller til å verifisere fraværet eller mislocalization av et protein i en mutant.
Når imaging centrosomes og sentrosomen relaterte strukturer, ved hjelp av genetisk merkede markører i stedet for antistoffer er ikke bare eksperimentelt enklere, men også gir mer robuste og reproduserbare resultater. Derfor er bruken av genetisk merkede proteiner sentrosomalt en pålitelig metode for mekanistiske og kvantitative analyser som krever et stort datasett. For eksempel har bruk av genetisk merket sentrosomalt markører vært spesielt verdifullt for kvantifisering av centriole lengde. Slike analyser har avdekket at ulike mutasjoner kan klassifiseres i to kategorier basert på variasjon i centriole lengde. En kategorien inkluderer mutasjoner som change centriole lengde, men påvirker ikke standardavviket 1 og den andre kategorien inkluderer mutasjoner som påvirker både centriole lengde og standardavviket i lengde 11. Slike kvantitative data kan gi nyttig innsikt i funksjon av bestemte sentrosomalt gener. Sentrosomalt mutanter som viser defekt centriole lengde med en økning i standardavvik kan skyldes en destabilisering av centriolar struktur. Imidlertid kan defekte centriole lengde med en vanlig standard feil indikerer at mutasjonen ikke strukturelt destabilisere centriole og er mer sannsynlig å være på grunn av en endring i reguleringsmekanisme som kontrollerer centriole lengde. På grunn av uregelmessigheter i farging, kvantitative analyser er vanskelig ved bruk av antistoffmarkører alene.
Sentrosomen er en stor, kompleks proteinstruktur og mange av sine proteiner er bare funnet innenfor sitt interiør. Ved hjelp av genetisk kodet sentrosomaltmarkører heller antistoffene gjør det mulig å konsekvent merke interne komponentene i sentrosomen hvis epitoper kan være ellers utilgjengelige for antistoff markører. For eksempel lokaliseringsstudier av Bld10 hjelp av antistoffer synes proteinet å bli beriket på den distale og proksimale ender av centriole 13, mens Bld10-GFP viser en mer jevn fordeling 1.. Det er imidlertid også viktig å vurdere nivået av ekspresjon av et spesielt rekombinant DNA-kodede protein, da dette kan påvirke proteinfordeling. Lokalisering av Sas-4-GFP og SAS-6-GFP uttrykt under deres endogene er begrenset til de proksimale ender av centriole 1,16,35 På den annen side, Sas-4-GFP og SAS-6-GFP uttrykt under sterk ubiquitin promoter er lokalisert langs hele lengden av centriole 12,14. Et annet viktig hensyn er effekten av den genetiske koden på proteinfunksjon. Analysere om genetisk merkede proteiner er funksjonelle kan være tested ved å innføre den transgene protein inn i en mutant bakgrunn og undersøke om det transgene protein befrir den mutante fenotype.
Fiksering av Drosophila testikler kan utføres ved hjelp av en rekke kjemiske fiksativ. Her beskriver vi fiksering med både formaldehyd (spor B) og metanol-aceton (spor C). Imidlertid kan enten fiksativ kan brukes om hverandre, og siden ulike fiksativ kan kjemisk forstyrre opprinnelige antistoff-epitoper, må valg av passende fikseringsmiddel for farging bestemmes eksperimentelt. De følgende fiksativ og inkuberingsbetingelser som vanligvis benyttes er: 3,7% formaldehyd, 5 minutter ved romtemperatur; metanol, 15 min ved -20 ° C, aceton, 10 min ved -20 ° C, metanol, 15 min ved -20 ° C. etterfulgt av aceton, 30 sek ved -20 ° C, etanol, 20 min ved -20 ° C. Selv om fiksering med aceton, metanol og etanol ikke krever en utvidet permeabilization trinn for farging, fiksering with formaldehyd bør etterfølges av en 1-timers inkubasjon i PBST-B ved værelsestemperatur til permeabilize cellemembraner og tillater antistoff tilgang til intracellulære epitoper. Videre er visse fiksativ er mer egnet for spesielle antigener. For eksempel formaldehyd fungerer godt for fiksering av små proteiner, mens metanol og aceton er egnet for fiksering av store molekylære komplekser 36.
Farging av Drosophila prøvene har blitt tidligere beskrevet for å observere kromatin strukturer og microtubuli cytoskjelettet 29,37. Her (spor C), har prosedyren er optimalisert for analyse av sentrosomalt strukturer som inneholder genetisk merkede proteiner. Vi gir en detaljert beskrivelse av denne fremgangsmåten for å veilede personer som er uerfarne i å jobbe i Drosophila testikler. Denne fremgangsmåten omfatter også modifiseringer for å forbedre bevaring og morfologien til testiklene, for eksempel ved hjelp av siliconized Dekk og positivt ladede glass objektglass.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend (R01GM098394) fra NIH og National Institute of General Medical Sciences samt tilskudd 1.121.176 fra National Science Foundation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |